牛病毒性腹泻病毒RT-PCR检测方法的建立及5’-UTR基因遗传变异分析

论文摘要

牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus,BVDV）属黄病毒科（Flaviviridae）瘟病毒属（Pestivirus）,为单股正链RNA病毒,基因组全长约12-13kb。由5’端非编码区（5’-UTR）、一个大的开放阅读框架区（ORF）和3’端非编码区（3’-UTR）三部分组成。其中,5’-UTR基因序列在BVDV不同毒株间高度保守,BVDV探针和BVDV分型常根据此段序列合成引物。根据BVDV 5’-UTR基因序列的不同可以将BVDV分成BVDV-I型和BVDV-II型两种基因型。BVDV-I型又可以进一步分为BVDV-Ia亚型,BVDV-Ib亚型。近年来,在猪瘟疫苗及发病猪群中均发现了BVDV。然而猪感染BVDV后一般不表现典型的BVD临床症状,部分感染猪可能出现体温升高,或者与猪瘟相似的病理变化和临床表现。由于BVDV与猪瘟病毒（CSFV）具有很高的同源性,两者容易混淆,确诊困难。因此,开展BVDV检测方法的研究,确定发病猪群中BVDV的分型、遗传变异情况,对预防和控制猪群中BVDV的流行显得尤为重要。本试验依据GenBank中发表的BVDV 5’-UTR核酸序列,兼顾不同血清型之间、与其他瘟病毒之间、Ⅰ型与Ⅱ型之间的序列差异,建立了扩增BVDV 5’-UTR基因序列中最保守一段的RT-PCR检测方法,预计片段长度为218 bp。标准毒株Oregon C24V用本方法扩增出了与预期一致的218 bp片段,而CSFV、牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）、蓝舌病病毒（BTV）、猪伪狂犬病毒（PRV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、正常MDBK细胞均未扩增出片段。应用本方法检测标准毒株细胞毒,敏感度达10-1 TCID50。在检测的70份疑似发病猪样品中,约15.7 %为阳性。检测的5份用于细胞培养的进口及国产犊牛血清中,分别有一份进口血清和一份国产血清为阳性。证实本方法具有较好的特异性、灵敏性以及高效、快速的特点。阳性样品处理后接种MDBK细胞,得到了12株分离病毒。命名为SX12、SX32、TJ287、XY60、27、NXQ、SX59、SX57、SX27、13、SX54、XY55。其中一些毒株在MDBK细胞上出现与BVDV标准毒株相同的典型的CPE,但有的在MDBK细胞上无CPE发生。RT-PCR检测12株分离毒株,结果显示12株全为阳性,检测正常的MDBK细胞则未发现任何片段。利用T4连接酶将12株分离毒株PCR产物连接到PGEM-Teasy载体上,构建PGEM-Teasy/5’-UTR重组克隆质粒将其转化入DH5α工程菌,挑取蓝白斑筛选出的阳性菌落,在LB培养液中进行放大培养,提取质粒进行PCR鉴定和酶切鉴定。结果表明,经连接转化所获得的质粒为含有目的片段的重组质粒,重组质粒中含有正确插入载体的5’-UTR基因。对克隆的基因片段进行测序,并进一步与已发表的BVDV代表毒株比对,用DNAstar软件分析同源性,结果表明这些克隆片段都是BVDV序列,这些毒株与BVDV I型间的同源性为77.9%- 98.6%,与BVDV- II型的同源性为56.2%- 66.5%。表明这些毒株均属于BVDV I型。并且可以进一步分为两个亚群,SX12、SX32、TJ287、XY60、27、NXQ、SX59、SX57、SX27、13属于BVDV-Ia亚型,SX54、XY55属于BVDV-Ib亚型。本试验用建立的检测方法,分离鉴定了12株来自陕西等5省的猪源BVDV毒株并且进行5’-UTR基因重要区域克隆和序列分析,从分子水平上描述了目前我国猪感染BVDV的情况和流行趋势,为更好的预防和控制BVDV在猪群中的流行提供重要的理论依据。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 文献综述
• 第一章 牛病毒性腹泻病研究进展
• 1.1 病原学
• 1.2 分子生物学特征
• 1.2.1 基因组结构
• 1.2.2 编码的蛋白
• 1.3 BVDV 流行病学研究进展
• 1.3.1 传染源
• 1.3.2 传播途径
• 1.3.3 易感动物
• 1.3.4 BVD 流行的原因分析
• 1.4 试验室诊断技术研究进展
• 1.4.1 血清学诊断方法
• 1.4.2 免疫学诊断方法
• 1.4.3 分子生物学诊断技术
• 1.5 BVD 防治研究进展
• 1.5.1 免疫预防
• 1.5.2 药物防治
• 1.5.3 其他防治措施
• 1.6 本研究的目的意义
• 试验研究
• 第二章 BVDV RT-PCR 检测方法的建立
• 2.1 材料
• 2.1.1 毒株
• 2.1.2 样品来源
• 2.1.3 所需的主要试剂
• 2.1.4 所需主要仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 引物设计与合成
• 2.2.2 样品总RNA 的提取
• 2.2.3 RT-PCR 扩增及鉴定
• 2.2.4 PCR 扩增产物的凝胶电泳
• 2.2.5 RT-PCR 检测方法验证
• 2.3 结果
• 2.3.1 RT-PCR 扩增及鉴定
• 2.3.2 RT-PCR 特异性试验
• 2.3.3 RT-PCR 敏感性试验
• 2.3.4 RT-PCR 重复性试验
• 2.3.5 RT-PCR 应用性检测
• 2.4 讨论
• 2.5 小结
• 第三章 BVDV 病毒的分离及鉴定
• 3.1 材料
• 3.1.1 细胞及组织样品
• 3.1.2 细胞培养所需主要试剂
• 3.1.3 所需主要仪器
• 3.2 方法
• 3.2.1 细胞培养
• 3.2.2 病料的处理
• 3.2.3 接种病毒
• 3.3 细胞培养及病毒增殖结果
• 3.3.1 细胞培养物病变结果
• 3.3.2 RT-PCR 检测结果
• 3.4 讨论
• 3.5 小结
• 第四章 BVDV 分离株5'-UTR 基因的克隆及遗传变异分析
• 4.1 材料
• 4.1.1 所需主要试剂
• 4.1.2 所需主要仪器
• 4.1.3 主要溶液配方
• 4.1.4 分析软件
• 4.2 方法
• 4.2.1 扩增产物的纯化
• 4.2.2 重组质粒PGEM-Teasy/5'-UTR 的构建
• 4.2.3 DH5α感受态细胞的制备
• 4.2.4 连接产物的转化
• 4.2.5 重组子的筛选及质粒的提取
• 4.2.6 重组质粒的鉴定
• 4.2.7 克隆片段的测序及同源性分析
• 4.3 结果
• 4.3.1 重组质粒PGEM-Teasy/5'-UTR 的酶切鉴定及PCR 鉴定
• 4.3.2 扩增片段的序列测定及同源性分析结果
• 4.4 讨论
• 4.5 小结
• 结论
• 参考文献
• 英文缩略词及中英文对照
• 致谢
• 作者简历