人源异戊二烯焦磷酸异构酶及真核起始因子2B的结构生物学研究

论文摘要

1.人源异戊二烯焦磷酸异构酶的结构生物学研究人源异戊二烯焦磷酸异构酶（IPP异构酶）是异戊二烯类化合物生物合成途径中的关键性的酶,它催化异戊二烯焦磷酸（IPP）与二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）之间的相互异构转化,而异戊二烯焦磷酸和二甲基烯丙基焦磷酸则是数目众多的异戊二烯类化合物的共同前体。这里我们首先用单波长反常散射的办法解析了人源IPP异构酶1.6（?）的晶体结构,其空间群为P212121,并随后得到了另外两种不同晶型的晶体结构,空间群分别是C2和P1,其中空间群P1的晶体中是无机培养基表达的硒代蛋白,它们都与大肠杆菌中同源蛋白的结构相似。这些结构首先展示了在人源IPP异构酶的N端区域存在着一个不稳定的α螺旋,在空间群C2和P1的晶体结构中这个α螺旋是形成的,但是在空间群P212121的晶体结构中却打开成了一个无规则卷曲,这个α螺旋覆盖在IPP异构酶活性口袋的上方,可能控制底物的进出。然后在空间群P1的晶体结构中,发现在活性口袋中结合了一个可能来自大肠杆菌的底物类似物焦磷酸乙醇胺（EIPP）,根据这个结构我们认为IPP异构酶催化的底物IPP质子化与去质子化反应中质子的供体可能是结合在活性口袋中的一个水分子,并且很可能IPP和DMAPP采用不同的构象结合IPP异构酶。另外这三个不同晶型的晶体结构中活性相关的氨基酸的构象并不完全相同,据此我们认为人源IPP异构酶中存在着一个底物诱导的活性位点构象变化的过程。最后根据空间群P212121的晶体结构,我们提出了一个高浓度的Mn2+抑制人源IPP异构酶活性的机理。2.人源真核翻译起始因子eIF2B的结构生物学研究真核翻译起始过程是一个复杂的过程,其主要目的是为了使mRNA能够结合在核糖体上并使得起始Met-tRNAi与mRNA上的AUG起始密码子正确配对,从而可以开始肽链的延伸过程。这个翻译起始过程需要很多蛋白质的帮助,它们被称为真核起始因子（eukaryotic initiation factor,eIF）。其中eIF2是携带起始Met-tRNAi结合到核糖体的重要因子,它只有在结合GTP时才能携带起始Met-tRNAi,但是正常情况下eIF2对GDP的亲和力要高于GTP,所以这时就需要一个鸟苷酸交换因子eIF2B的帮助把eIF2·GDP变为eIF2·GTP,这个鸟苷酸交换反应是整个翻译起始过程最重要的调控点之一。eIF2B是一个包含五个亚基的大复合物,它又可以分为调节亚复合物和催化亚复合物,其中由α,β和δ亚基组成的调节亚复合物主要应对eIF2磷酸化对eIF2B活性的抑制作用,而由γ和ε亚基组成的催化亚复合物则主要发挥催化鸟苷酸交换的活性。我们表达纯化了人源eIF2Bα亚基并用分子置换的方法解析了其2.6（?）分辨率的晶体结构,eIF2Bα的结构包含两个结构域,N端结构域和C端结构域,根据以前生化研究的结果我们描述了eIF2Bα上一个可能与eIF2或磷酸化eIF2相互作用的表面,并认为其C端结构域中的Rossmann折叠花样可能介导了其与β及δ亚基形成调节亚复合物,除此之外,我们还根据eIF2Bα的结构提出了其中两个被鉴定与一类人遗传疾病VWM相关的突变致病的可能机理。另外,我们克隆并表达纯化了人源eIF2Bε亚基的C端结构域并收集了两套不同分辨率的晶体衍射数据,这个结构域被证明是整个eIF2B复合物中最核心的发挥催化鸟苷酸交换活性的区域,其晶体结构的解析还在进行中,同时我们还克隆表达并纯化了融合MBP的人源eIF2Bβ和γ亚基蛋白。所有的这些工作为以后进一步eIF2B复合物的结构生物学研究打下了基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一部分 人源异戊二烯焦磷酸异构酶（IPP异构酶）的结构生物学研究
• 第一章 绪论—异戊二烯焦磷酸异构酶的研究概述
• 1.1 异戊二烯类化合物生物合成途径与药物设计
• 1.2 异戊二烯焦磷酸异构酶的分类与功能
• 1.3 对于异戊二烯焦磷酸异构酶催化机理的生化研究
• 1.4 大肠杆菌异戊二烯异构酶的结构生物学研究
• 1.5 异戊二烯焦磷酸异构酶与药物设计
• 第二章 人源异戊二烯焦磷酸异构酶基因的克隆,蛋白的表达纯化,晶体的生长和结构解析
• 2.1 人源异戊二烯焦磷酸异构酶的克隆与表达载体构建
• 2.2 人源异戊二烯焦磷酸异构酶的表达纯化和晶体筛选
• 2.3 晶体衍射数据的收集和处理
• 2.4 晶体结构的解析与分析
• 第三章 实验结果与分析讨论
• 3.1 实验结果
• 3.1.1 两种分别带有N端与C端His-tag的蛋白性质的区别
• 3.1.2 人源异戊二烯焦磷酸异构酶的晶体结构的解析过程
• 3.1.3 人源与大肠杆菌异戊二烯焦磷酸异构酶结构的比较
• 3.1.4 三种人源异戊二烯焦磷酸异构酶的结构主链上的区别
• 3.1.5 hIPPI3结构中底物类似物及三种结构中活性口袋构象的不同
• 3.1.6 hIPPl3结构中底物类似物的结合
• 3.2 人源IPP异构酶结构的分析与讨论
• 3.2.1 焦磷酸乙醇胺（EAPP）可能是人源IPP异构酶的抑制剂
• 3.2.2 N端不稳定的α螺旋打开或形成的可能机理
• 3.2.3 在质子化与去质子化过程中可能的质子供体与反应的可逆性
• 3.2.4 人源异戊二烯焦磷酸异构酶中底物诱导的活性位点构象变化
• 2+抑制人源异戊二烯焦磷酸异构酶活性的机理'>3.2.5 高浓度Mn²⁺抑制人源异戊二烯焦磷酸异构酶活性的机理
• 3.3 结论
• 第一部分 参考文献
• 第二部分 人源真核起始因子2B（EIF2B）的结构生物学研究
• 第一章 绪论—真核翻译起始过程及EIF2B的功能和调控
• 1.1 真核翻译起始过程在基因表达调控中的作用
• 1.2 真核翻译起始的过程
• 1.3 两种重要的翻译起始因子eIF2和eIF2B的组成和功能
• 1.3.1 eIF2（α）的磷酸化对于eIF2B活性的抑制
• 1.3.2 酵母和哺乳动物细胞中eIF2B的组成
• 1.3.3 eIF2B活性的抑制对于翻译过程的影响
• 1.4 eIF2（α）的磷酸化
• 1.5 eIF2与eIF2B的相互作用及可能的磷酸化eIF2的抑制机理
• 1.6 eIF2B催化eIF2鸟苷酸交换的机理
• 1.7 eIF2B与人类疾病
• 1.7.1 白质消失（VWM）
• 1.7.2 糖尿病与癌症
• 第二章 实验设计与实验方法
• 2.1 人源eIF2B五个亚基的克隆构建
• 2.1.1 人源eIF2Bα和eIF2Bε亚基的克隆构建
• 2.1.2 LIC克隆策略与人源eIF2Bβ,γ及δ亚基基因的克隆构建
• 2.1.3 eIF2Bε亚基C端区域的克隆构建
• 2.2 人源eIF2B五个亚基的表达与纯化
• 2.2.1 人源eIF2Bα蛋白的表达纯化
• 2.2.2 融合MBP的人源eIFBβ和eIF2Bγ蛋白的表达纯化
• 2.2.3 人源eIF2BεCTD蛋白的表达纯化
• 2.2.4 其它人源eIF2B亚基全长蛋白的表达
• 2.3 人源eIF2Bα与eIF2BεCTD蛋白的晶体生长
• 2.4 人源eIF2Bα与eIF2BεCTD蛋白的数据收集及人源eIF2Bα晶体结构的解析
• 第三章 实验结果与分析讨论
• 3.1 人源eIF2Bα亚基的结构
• 3.1.1 人源eIF2Bα亚基的整体结构
• 3.1.2 人源eIF2Bα亚基中可能参与与eIF2结合的表面
• 3.1.3 人源eIF2Bα亚基中Rossmann折叠可能参与形成调节亚复合物
• 3.1.4 人源eIF2Bα与肾上腺素受体之间可能的相互作用模型
• 3.1.5 人源eIF2Bα与疾病CACH/VWM相关的两个突变
• 3.2 人源eIF2Bε亚基C端结构域的晶体衍射数据收集
• 3.3 人源eIF2B其它亚基的表达纯化
• 3.4 结论与展望
• 第二部份 参考文献
• 附录 博士期间其它主要完成的工作
• 致谢
• 在读期间发表的学术论文