论文摘要
目的:本实验旨在探讨胰高血糖素样肽-1（glucagon-like peptide-1,GLP-1）对内质网应激诱导胰岛β细胞凋亡的影响及可能的相关机制。方法:应用体外培养的大鼠胰岛β细胞系-r9细胞,通过不同作用浓度和作用时间的毒胡萝卜素（Thapsigargin,TG）诱导r9细胞,采用AnnexinⅤ-PI流式细胞仪和DNA凝胶电泳分析细胞凋亡情况,确定TG的最佳作用浓度和作用时间,然后选用100 nmol/L毒胡萝卜素作为胰岛β细胞凋亡的诱导剂,分别采用MTT、DNA凝胶电泳、TUNEL染色、AnnexinⅤ-PI流式细胞仪定量分析,比较GLP-1和GLP-1受体激动剂exendin-4对胰岛β细胞凋亡的影响,并进一步通过检测细胞色素c的释放,凋亡蛋白Caspase3的活性和活性氧（ROS）的水平,评价GLP-1和exendin-4对TG诱导胰岛β细胞凋亡的影响及可能机制。结果:1. AnnexinⅤ-PI流式细胞仪和DNA凝胶电泳结果显示,0、10、100、300nmol/L毒胡萝卜素作用r9细胞12小时后及100nmol/L TG分别作用0、6、12、24小时,细胞凋亡率均依次增加,呈明显剂量依赖性。100nmol/L毒胡萝卜素分别作用r9细胞0、6、9、12、24小时后细胞凋亡也呈明显的时间依赖性;2.MTT结果显示,100nmol/L毒胡萝卜素作用r9细胞时,GLP-1和Exendin-4能明显降低TG对r9细胞增殖的抑制作用;3.DNA凝胶电泳结果显示,100nmol/L的毒胡萝卜素作用后r9细胞的DNA出现明显片段化,而给予GLP-1或Exendin-4组则条带较淡。TUNEL染色和Hochest33342-PI染色进一步证明这一结果。AnnexinⅤ-PI流式细胞仪定量分析显示,TG处理的r9细胞早期凋亡率为26.7%,明显高于正常对照组（4.5%）,两组间统计学差异非常显著（p<0.01）。联合加入GLP-1或Exendin-4的细胞早期细胞凋亡率分别下降到19.7%和19.2%,组间统计学差异显著（p<0.05）;4.细胞浆蛋白的Western blot检测结果显示,正常情况下,细胞浆中可检测到少量的细胞色素c,给予TG后释放到胞浆中的细胞色素c明显增多,联合给予GLP-1或Exendin-4能减少胞浆中的Cytc的释放;5.细胞线粒体活性氧的释放检测结果显示,正常情况下,细胞浆中可检测到一定量的活性氧ROS,给予TG后释放的活性氧明显增多,给予GLP-1和Exendin-4能减少活性氧的释放;6.细胞浆中凋亡蛋白酶caspase3的检测结果显示,正常情况下,细胞浆中可检测到一定量的caspase3,给予TG后激活的caspase3明显增多,给予GLP-1和Exendin-4能抑制caspase3的激活和释放。结论:毒胡萝卜素能诱导胰岛β细胞凋亡,且呈剂量和时间依赖性;毒胡萝卜素诱导的胰岛β细胞凋亡可被GLP-1或Exendin-4抑制;GLP-1和Exendin-4抑制内质网应激诱导β凋亡的机制与减少细胞色素c释放、降低活性氧产生和抑制caspase3的活性有关。