诱导HIV-1中和抗体的膜蛋白抗原的优化和改造

论文摘要

自1981年确认首例艾滋病以来,艾滋病已成为对人类健康和社会稳定威胁最大的感染性疾病之一。研制有效的艾滋病疫苗是控制艾滋病流行甚至根除AIDS的理想途径。选择合适的抗原作为免疫原以诱导强效、广谱的中和抗体一直是疫苗研究的重要的基础。HIV-1膜抗原位于HIV的表面,是中和抗体主要作用靶位。但天然HIV-1膜蛋白免疫原性低,很难诱导出强效广谱的中和抗体,因而需要对其进行优化改造以提高中和表位的免疫原性,增强其诱导中和抗体的能力。本研究以一株CRF07BC亚型的假病毒株S939为原始株,对其膜区进行改造以暴露某些保守中和表位,通过单抗、阳性血清的中和试验来验证改造效果,最终获得一株对中和性单克隆抗体和HIV-1感染阳性血清均敏感、中和特性强的假病毒,为候选疫苗的抗原选择和优化提供依据。本课题根据已知的单抗识别表位、已报道的能增强病毒对单抗敏感性的位点和N-连接糖基化位点为依据,对S939 Env设计突变,通过环形诱变,DpnI酶筛选的方式得到突变体,酶切初步鉴定,测序确定突变结果。将含有突变env的真核表达质粒与HIV-1骨架质粒pSG3△env共转染293FT细胞,收集上清获得假病毒,通过假病毒单轮感染TZM-bl细胞检测假病毒滴度和突变位点对假病毒感染能力的影响。用HIV-1中和性单抗、HIV-1感染的阳性血清来检测改造位点对假病毒中和特性的影响。单抗2F5、4E10识别gp41近膜区（MPER）上的线性表位,在S939上对该表位进行联合改造,改造后的假病毒FE相比原始株S939感染力无显著变化。FE对单抗2F5敏感性较S939提高11倍以上,对单抗4E10敏感性无明显变化。在FE上进行单抗2G12表位的改造（I295N、N334S和D386N）获得假病毒株FE-2G12,其感染力较FE略微增强。2G12表位的改造没有使假病毒FE-2G12对单抗2G12敏感,反而降低了对单抗b12和部分阳性血清的敏感性。在FE上进行了8个已报道的增强病毒中和活性位点的改造,其中6个位点的突变I309L、L669S、G458A、T569A、I675V和D180N显著降低了病毒的感染力,因而不能进行其对病毒中和特性影响的评价。其余两个突变中,S365A增强了病毒的感染力,F22L对病毒感染力无影响,这两个突变均没有增强病毒的中和活性。以FE为模板,对25个N-连接的糖基化位点进行单独删除,共获得25个含有单个糖基化删除的Env表达质粒,并与pSG3△env质粒共转染293FT细胞收获假病毒。对这25个假病毒感染力的检测发现,其中5个分布在V1/V2,C1/C2区糖基化位点的删除严重影响了病毒的感染力,含有这5个删除位点的假病毒检测不到其感染能力。分布在免疫反应静默面（immunologically-silent face domains）V4、C4和V5区域中的糖基化位点的删除（除了N392 （V4））对假病毒的感染性有一定的增强。其他糖基化位点的删除均不同程度的减弱了假病毒的感染能力。在假病毒中和特性方面,糖基化位点N197 （C2）,N301 （V3）,N442 （C4）和N625（gp41）的删除使假病毒对部分HIV-1阳性血清、抗CD4结合位点抗体b12和抗gp41抗体2F5和4E10更加敏感。N142 （V1）的删除使假病毒对单抗b12,2F5和4E10敏感性增强,但对HIV-1阳性血清敏感性没有影响。N355 （C3）和N463 （V5）的删除使假病毒对2F5和4E10敏感性增强。根据前几部分的改造结果,选择其中能对病毒中和活性显著增强的位点,结合V5（N463、N466）和C3（N339）区的糖基化位点以及与N442临近的N448的删除,在FE上按不同组合进行了联合改造,共获得了7株联合突变假病毒,其中除197M-4外,均显著降低了病毒的感染力。对其中6株假病毒的中和特性分析发现,相比于原始株S939、改造株FE以及单个糖基化位点的改造,联合突变株对单抗2F5、4E10和b12,以及大部分阳性血清,均显示出了很强的敏感性。本实验通过对55个氨基酸位点的突变改造,发现了一些能够显著影响病毒感染能力的位点,发现了一些能显著增强病毒中和特性的位点。通过联合改造,最终获得了几株对HIV-1中和单抗和阳性血清表现出较强中和特性的假病毒株,为HIV-1膜蛋白的优化改造以及候选膜抗原的选择提供了依据。

论文目录

• 英文缩略词
• 摘要
• Abstract
• 一、前言
• 1.1 HIV-1 病毒
• 1.2 HIV-1 病毒形态
• 1.3 HIV-1 主要结构蛋白
• 1.4 HIV-1 中和抗体
• 1.5 糖基化位点对HIV-1 感染和中和特性的影响
• 二、实验材料和方法
• 2.1 材料、仪器和试剂
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 主要仪器
• 2.1.3 常用溶液
• 2.2 方法
• 2.2.1 大肠杆菌E.coli 化学感受态的制备
• 2.2.2 定点突变
• 2.2.3 转化大肠杆菌E.coli 化学感受态细胞
• 2.2.4 质粒的小量提取
• 2.2.5 质粒酶切鉴定
• 2.2.6 质粒的大量提取
• 2.2.7 质粒的定量
• 2.2.8 利用LIPOFECTAMINE 2000 进行转染
• 2.2.9 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
• 2.2.10 Western Blot
• 2.2.11 功能性假病毒的获得
• 2.2.12 假病毒P24 含量的测定
• 2.2.13 假病毒相对感染能力的测定
• 2.2.14 功能性假病毒的滴度测定
• 2.2.15 中和试验操作流程
• 三、实验结果
• 3.1 HIV-1 膜抗原的优化改造
• 3.1.1 原始Env 的选择
• 3.1.2 突变位点的选择
• 3.1.3 突变克隆的获得
• 3.1.4 质粒的酶切鉴定
• 3.1.5 原始及25 个糖基化位点单独删除克隆的体外表达
• 3.1.6 Env 改造对假病毒感染能力的影响
• 3.1.7 Env 改造对假病毒中和特性的影响
• 3.2 HIV-1 膜抗原上多个糖基化位点的联合改造
• 3.2.1 糖基化的联合删除对假病毒感染能力的影响
• 3.2.2 糖基化的联合删除对假病毒中和特性的影响
• 四、讨论
• 小结
• 参考文献
• 综述 艾滋病疫苗研究现状
• 参考文献
• 致谢