GLT-1的剪接变异体GLT-1a在脑缺血耐受诱导中的作用

论文摘要

谷氨酸是脑内最重要的兴奋性氨基酸,严重的脑缺血缺氧会导致其浓度显著升高,产生神经毒性效应。脑中缺乏谷氨酸的代谢酶,释放到细胞外液中的谷氨酸只能由谷氨酸转运蛋白重新摄入星型胶质细胞和/或神经元。目前已发现五种高亲和力兴奋性氨基酸转运体EAATs（excitatory amino acid transporters）,包括EAAT1（glutamate/aspartate transporter, GLAST）、EAAT2（glail glutamate transporter-1,GLT-1）、EAAT3（EAAC1）、EAAT4和EAAT5。在这些转运体中,星形胶质细胞转运体GLT-1承担了约90%的转运功能。1990年Kitagawa证实动物突然受到较严重的缺血打击时,海马CA1区神经元会大量死亡。若在此之前给动物造成轻微、短时、不至于引起神经元死亡的脑缺血,可对其后的通常会引起神经元损伤的较严重脑缺血产生保护作用。预先给予的轻微短时的脑缺血称为脑缺血预处理（cerebral ischemic preconditioning, CIP）。所产生的保护作用称为脑缺血耐受（brain ischemic tolerance, BIT）。BIT现象在动物模型和临床实践中都有报道。张等报道CIP可使大鼠海马CA1区星形胶质细胞突起延长并且紧紧环绕锥体神经元,并表达大量的GLT-1,从而增强了对谷氨酸的摄取能力;损伤性脑缺血会导致大鼠海马CA1区GLT-1表达下调,尤其在死亡的锥体细胞周围更加明显;应用GLT-1的抑制剂（dihydrokainate, DHK）抑制GLT-1的功能或应用GLT-1的反义寡核苷酸来减少GLT-1的表达和功能,均可抑制CIP的脑保护作用。以上结果表明GLT-1确实参与了缺血时CIP所诱导的脑缺血耐受。GLT-1存在多种剪接变异体。根据GLT-1羧基端氨基酸序列的不同,在大鼠上发现了3中剪接变异体,即GLT-1a、GLT-1b和GLT-1c。GLT-1a与GLT-1b广泛分布在中枢神经系统;GLT-1c主要存在于视网膜神经元。其中GLT-1a是其中最主要的部分。在不同的病理情况下,GLT-1的剪接变异体的表达可发生相应的变化。例如在脊髓侧索硬化模型的脑组织中,观察到了GLT-1a和GLT-1b表达的下调。而在脊髓侧索硬化的病人脑组织中观察到GLT-1b蛋白的表达明显上调,而GLT-1a蛋白的表达明显下调。大鼠在接受慢性自限性应激刺激时,GLT-1a的mRNA和蛋白表达在海马的齿状回和CA3区升高,而GLT-1b的蛋白的升高却发生在整个海马。新出生的猪遭受缺氧打击时,神经元上诱导出了GLT-1b的表达升高和GLT-1a的表达下降。外伤性脑损伤时,GLT-1a的表达在海马升高,GLT-1b在皮层、海马和下丘脑都下降。但是,何种类型的剪接变异体在脑缺血耐受诱导过程中发挥作用,目前尚未见到任何相关报道。因此,本课题拟在以往研究证实GLT-1确实参与整体情况下脑缺血预处理所诱导的脑缺血耐受的基础上,进一步研究GLT-1 a这个剪接变异体是否参与了脑缺血预处理所诱导的脑缺血耐受。1 GLT-1a在CIP诱导的脑缺血耐受中的表达采用大鼠四血管闭塞（4 vessel occlusion,4 VO）全脑缺血模型,应用脑组织病理学评价、免疫组织化学和Western blot分析等方法,观察在脑缺血耐受诱导过程中海马CA1区GLT-1a的表达。方法:雄性wistar大鼠135只,随机分为5组:（1） Sham组（n=20）:大鼠暴露于脑缺血的各个sham手术,包括暴露双侧椎动脉和2天后再暴露双侧颈总动脉;（2） VAO组（n=20）:大鼠接受永久凝闭椎动脉的手术,2天后暴露颈总动脉;（3） CIP组（n=65）:本组及以下各组实验都在VAO的基础上进行。大鼠在VAO后2天夹闭颈总动脉造成全脑缺血3 min;（4）损伤性缺血组（n=65）:大鼠在VAO后2天夹闭颈总动脉造成损伤性全脑缺血8 min;（5） CIP+损伤性缺血组（n =65）:首先大鼠接受脑缺血3 min的CIP实验,2天后再接受损伤性全脑缺血8 min的实验,以观察CIP的脑缺血保护作用。首先在末次脑缺血或sham手术后7天,每组取材5只,用于神经病理学评估和免疫组织化学分析。其次,采用western blot法分析GLT-1a在脑缺血耐受中的动态变化,选择CIP、损伤性缺血和CIP+损伤性缺血三个组,每组45只,分别于最后一次缺血后0 h、3 h、6 h、12 h、1 d、2 d、3 d、5 d和7 d等9个时间点取海马CA1区（n=5）。最后,各组选择于最后一次缺血或sham手术后1 d、2 d和7 d （每个时间点n=5）三个时间点取材,通过western blot法来比较观察在这三个不同时间点时,各组在GLT-1a表达上的差别。结果:1.1脑组织病理学评价:采用硫堇染色来观察海马CA1区迟发性神经元死亡（delayed neuronal death, DND）情况。根据以下标准确定组织学分级（Historical grade,HG）:0级,无神经元死亡;Ⅰ级,散在神经元死亡;Ⅱ级,成片神经元死亡;Ⅲ级,几乎全部神经元死亡。计数海马CA1区1 mm段内细胞膜完整、胞核饱满、核仁清晰的锥体细胞数目,每张切片双侧海马各计数3个区段取平均数作为神经元密度（Neuronal density, ND）。硫堇染色显示,sham组大鼠海马CA1区锥体神经元排列整齐致密,细胞形态完整、边界清晰、尼氏小体丰富,胞核大而圆、核仁清晰。VAO和CIP组大鼠海马CA1区未见明显神经元损失,与sham组相比,HG、ND也均无明显变化。损伤性脑缺血组大鼠于缺血后7天时,可见神经元几乎全部死亡,与VAO或CIP组相比,HG明显升高,ND明显减少（p<0.01）。CIP+损伤性脑缺血组中大鼠海马CA1区锥体细胞排列整齐致密,胞核饱满,核仁较清晰,仅个别锥体细胞胞核固缩,无明显细胞缺失,与损伤性脑缺血组相比,HG明显降低,ND明显升高（p<0.01）。这些结果表明,CIP对2天后发生的严重脑缺血损伤有明显的保护作用。1.2 Western blot分析首先观察了CIP组、缺血损伤组和CIP+缺血损伤组中GLT-1a的表达在末次缺血后0 h、3 h、6 h、12 h、1 d、2 d、3 d、5 d和7 d等9个不同时间点的动态变化。从CIP组中看到GLT-1a的表达在3 h时间点开始升高,然后逐渐上调,并于CIP后1天时间点时达到峰值。这个高峰表达持续到2天,然后逐渐回降。在CIP后7天时,基本达到0 h时间点时的水平。在损伤性缺血组,GLT-1a的表达在3 h - 12 h时间点之间有一个短暂的升高,但是从缺血后2天开始,一个迟发性的表达下调就占据主导趋势,尤其是在5 d - 7 d时间点时就更加明显,其表达变得非常微弱。CIP+损伤性缺血组GLT-1a的表达从3 h开始升高,1天时达到高峰,并且一直持续到末次损伤性8 min缺血后7天。这些结果显示CIP或CIP+损伤性缺血都可以上调GLT-1a的表达,并可在损伤性脑缺血后持续较长的时间,且使损伤性脑缺血导致的表达下调得以翻转。在了解了不同时间点的动态变化后,选择了1 d、2 d和7 d三个时间点,来比较GLT-1a的表达各个组之间的差异。在1天时间点时,GLT-1a的表达在CIP组与sham组和VAO组之间相比出现明显上调。但是损伤性缺血组和sham组之间,CIP+损伤性缺血组和缺血组之间相比无明显变化。在2天时间点时,GLT-1a的表达在CIP组上调更加明显,另一个变化是GLT-1a的表达在CIP+损伤性缺血组与sham组和损伤性缺血组相比明显上调。在7天时间点时,除了在损伤性缺血组的表达明显低于sham组外,其余变化与2天时间点时相似。1.3免疫组织化学分析在sham组可以看到在海马CA1区的锥体神经元周围GLT-1a呈微弱、弥散性分布。与sham组相比,免疫组化染色的密度在VAO组轻微升高,在CIP组显著升高。在损伤性缺血组,GLT-1的表达显著降低,尤其是在锥体神经元几乎完全死亡的区域周围,GLT-1a的表达呈片状缺失。在CIP+损伤性缺血组,提前2天给予CIP之后,再给予损伤性的8 min缺血,GLT-1a的表达跟单纯8 min损伤性缺血相比明显上调。表现为很多星形胶质细胞及其突起呈现出强的点状、条状阳性标记,这些阳性颗粒存在于锥体神经元之间,并且包绕着这些神经元。以上结果表明,CIP上调了GLT-1a的表达,损伤性缺血下调GLT-1a的表达,CIP可以翻转损伤性缺血中GLT-1a的下调。2 GLT-1a的反义脱氧寡核苷酸（ antisense oligodeoxynucleotides, AS-ODNs）的设计、筛选和对CIP上调GLT-1a表达的抑制作用由于GLT-1a没有特异性抑制剂,所以设计了GLT-1a的AS-ODNs。通过在头孢曲松钠（Ceftriaxone,Cef）上调GLT-1a后水平进行筛选,并进而在sham水平和CIP上调GLT-1a表达后水平应用western blot和PCR技术观察了在蛋白和mRNA水平上GLT-1a AS-ODNs对GLT-1a表达的抑制效果,从而为研究GLT-1a的功能奠定了基础。2.1设计GLT-1a AS-ODNs针对GLT-1a mRNA羧基末端的特异序列,设计了5条GLT-1a AS-ODNs,依次为:P1:5’-AGCTGACTTTCCATTGGCCGC-3’P2:5’-GGTTCTTCCTCAACACTGCA-3’P3:5’-CACGTTTCCAAGGTTCTTCC-3’P4:5’-TTGGCTGAGAATCGGGTCATT-3’P5:5’-ATTGGCTGAGAATCGGGTC-3’2.2在Cef上调GLT-1a表达的基础上筛选有效的反义核苷酸链Rothstein等2005年在《Nature》上报道,β-内酰胺类抗生素,如Cef,可以特异性地增加GLT-1 mRNA和蛋白的表达,为有效筛选GLT-1a的有效反义核苷酸链奠定了基础。我们使用Cef上调了GLT-1a的表达,并以此为基础来筛选有效抑制GLT-1a蛋白表达的反义寡核苷酸链。方法:30只雄性Wistar大鼠（280-300 g）,提前5天于右侧脑室置管以建立侧脑室给药途径,随机分为6组（n=5）:（1）Cef组:大鼠腹腔注射Cef（200 mg/kg）,每日一次,共5次;分别在首次注射Cef后36 h、72 h和108 h向右侧脑室注射双蒸水10μl,作为溶剂对照;（2）（-6）组分别为Cef+AS-ODNs （P1）、Cef+AS-ODNs （P3）、Cef+AS-ODNs （P4）和Cef+AS-ODNs （P5）组,注射药物分别为P1、P2、P3、P4和P5,其余程序同Cef组。以上各组均于末次腹腔注射Cef后2 d时间点取材,用Western blot技术观察各反义寡核苷酸链对大鼠海马CA1区GLT-1a表达的影响。本部分以及后续实验中所有注射ODNs的大鼠,只取右侧（即注药侧）海马CA1区作为分析使用。2.3 GLT-1a的有效AS-ODNs对sham大鼠海马CA1区GLT-1a蛋白表达的影响上组通过筛选得到有效的AS-ODNs,本部分在正常大鼠上观察此GLT-1a AS-ODNs的抑制效果方法:雄性Wistar大鼠（280-300 g）,10只。提前5天于右侧脑室置管以建立侧脑室给药途径,随机分为2组:（1）sham组（n=5）侧脑室注射DW 10μl,每日一次,共6次;（2）AS-ODNs组（n=5）。以与sham组大鼠相同程序侧脑室注射GLT-1a AS-ODNs（15 nmol,10μl）。以上大鼠均于末次注射后2天取海马CA1区,应用Western blot技术观察GLT-1a的表达。2.4 GLT-1a的有效AS-ODNs在脑缺血模型上的应用方法:雄性Wistar大鼠（280-300 g）,115只。提前5天于右侧脑室置管以建立侧脑室给药途径。将状态良好的置管大鼠随机分为6组:（1） sham组（n=10）:大鼠于sham手术后2天取材。一半用于western blot分析,另一半用于RT-PCR检测;（2） VAO组（n=25）:20只大鼠于VAO后4天取材。其中,15只用于western blot分析,5只用于PCR检测。另外有5只在VAO后7天取材,并用于western blot检测;（3） CIP组（n=25）:20只大鼠于CIP后2天取材。其中,15只用于western blot分析,5只用于PCR检测。剩余5只在CIP后5天取材,并用于western blot检测;（4） CIP+GLT-1a AS-ODNs组（n=35）:25只大鼠以25 nmol的剂量在CIP前2d、1d和CIP后0 d、1d连续四次侧脑室注射,取材和观察方法同CIP组。此外,为了观察GLT-1a AS-ODNs的剂量依赖性,还设计了两个亚组。AS-ODNs的使用剂量分别为5 nmol （n=5）和15 nmol （n=5）,给药方式和程序完全同GLT-1a AS-ODNs 25 nmol。大鼠均于CIP后2天取材,并用western blot进行分析。（5）CIP+GLT-1a sense-ODNs组（n=10）:大鼠侧脑室注射GLT-1a sense-ODNs,剂量为25 nmol,给药程序同AS-ODNs。大鼠于CIP后2天取材,5只用于western blot分析,5只用于RT-PCR检测。（6）CIP+GLT-1a missense-ODNs group （n=10）:大鼠侧脑室注射GLT-1a missense-ODNs,其余所有处理同（5）组。结果:2.1设计了5条反义寡核苷酸序列2.2 GLT-1a AS-ODNs（P2）抑制了Cef对海马CA1区GLT-1a表达的上调Cef组大鼠海马CA1区可见较强的GLT-1a表达,与Cef组相比,Cef+AS-ODNs （P2）组GLT-1a的表达明显降低（P<0.05）,而其它各组GLT-1a的表达均无明显变化（P>0.05）。表明P2能够有效抑制大鼠海马CA1区GLT-1a蛋白的表达,是有效的AS-ODNs。2.3 GLT-1a AS-ODNs（P2）抑制sham组大鼠海马CA1区GLT-1a的基础表达与sham组相比,AS-ODNs组GLT-1a蛋白表达明显下降（P<0.05）。表明GLT-1a AS-ODNs可抑制正常大鼠海马CA1区GLT-1a的基础表达。2.4 GLT-1a AS-ODNs在脑缺血模型上的应用2.4.1 GLT-1a AS-ODNs对大鼠海马CA1区GLT-1a蛋白和mRNA的抑制sham 2d组大鼠可见海马CA1区GLT-1a蛋白的基础表达。与sham组相比,VAO 2d组GLT-1a蛋白的表达有一个轻度升高,CIP 2d又引起了表达的进一步升高（p<0.05）。给予GLT-1a AS-ODNs后明显抑制了CIP和VAO所引起的GLT-1a蛋白表达的上调（p<0.05）,其表现为GLT-1a的表达在CIP+AS-ODNs组与sham 2d,VAO 2d和CIP 2d组相比有明显下调。然而,给予GLT-1a Sense-或missense-ODNs对CIP引起的GLT-1a的表达无影响。GLT-1a的AS-ODNs在mRNA水平对CIP诱导的GLT-1a的mRNA表达上调表现为与蛋白水平相似的作用。2.4.2 GLT-1a AS-ODNs的抑制时间的观察VAO 2d时GLT-1a在海马CA1区有一定程度的表达,CIP 2d引起了表达的进一步增加,给予GLT-1a AS-ODNs后对VAO和CIP引起的GLT-1a蛋白的表达上调有明显的抑制作用,表现为与VAO组和CIP组相比,CIP 2d+AS-ODNs组GLT-1a蛋白表达明显下降（p<0.05）。VAO 5d时GLT-1a的表达与VAO 2d时相比明显降低,与VAO 5d相比,CIP 5d时GLT-1a的表达仍然较高,说明CIP对GLT-1a表达的上调至少可持续至5天。与CIP 5d组相比,GLT-1a AS-ODNs+CIP 5d组GLT-1a蛋白表达仍然较低,说明此AS-ODNs的抑制效应至少可以持续至5天。2.4.3 GLT-1a AS-ODNs的量效关系CIP 2d时,GLT-1a的表达呈现出一个较高水平,在CIP的基础上注射GLT-1a AS-ODNs 5 nmol达4次后,GLT-1a的表达基本没有变化;但是在给予GLT-1a AS-ODNs达15 nmol 4次后,GLT-1a的表达明显下降（p<0.05）;给予GLT-1a AS-ODNs达25 nmol 4次后,GLT-1a的表达进一步下降（p<0.05）。说明GLT-1a AS-ODNs的作用呈现出剂量依赖性。以上结果表明,GLT-1a AS-ODNs（P2）链可以抑制Cef上调的和sham大鼠海马CA1区GLT-1a的表达。在脑缺血模型上观察到GLT-1a AS-ODNs在蛋白和mRNA水平都可以抑制GLT-1a的表达。此外,CIP对GLT-1a表达的上调和GLT-1a AS-ODNs对在CIP基础上对GLT-1a表达的抑制作用都至少可以持续到5天以上。GLT-1a AS-ODNs的抑制作用具有剂量依赖性。3 GLT-1a AS-ODNs对脑缺血耐受大鼠模型海马CA1区脑透析液中氨基酸浓度的影响方法:雄性Wistar大鼠（280-300 g）,30只。本部分所有实验动物都在头顶埋置双管,一个在右侧脑室置管以给药,另一个位于同侧海马CA1区以备插入微透析探针。5天后,随机分为6组。本部分微透析实验在清醒动物上进行。（1） sham组:水合氯醛腹腔注射麻醉,暴露椎动脉后,再暴露颈总动脉并用线穿过其下方。2天后微透析时将穿过的线抽出,不阻断血流;（2） CIP组:永久凝闭双侧椎动脉,然后颈总动脉穿线。2天后微透析时将线勒紧造成缺血,时间为3分钟。然后将勒紧的线松开以恢复血液灌注;（3）损伤性缺血组:实验流程同CIP组,除外缺血时间为8 min;（4） CIP+损伤性缺血组:首先永久凝闭双侧椎动脉,2天后行CIP实验,如果大鼠缺血表现良好,则于颈总动脉穿线。2天后微透析时再勒紧线以造成8 min缺血;（5） GLT-1a AS-ODNs+CIP+损伤性缺血组:基本流程同（4）组。GLT-1a AS-ODNs溶液（25 nmol, 15μl）分别于CIP前2d、1d和CIP后0d、1d注射入侧脑室;（6） GLT-1a Sense-ODNs+CIP+损伤性缺血组:注射药物为GLT-1a sense-ODNs,其余同（5）组。以上各组所收集到的透析液,行高效液相检测,观察透析液中谷氨酸、天冬氨酸和γ-氨基丁酸浓度的变化。结果:除了GLT-1a AS-ODNs组基础谷氨酸浓度稍有增高外,其余各组在缺血前谷氨酸基础浓度基本无变化。sham组中,当把环绕在颈总动脉上的线抽出时,谷氨酸浓度基本无变化。在CIP组,3 min缺血引起谷氨酸浓度升高,达到基础值的1.7倍。8 min损伤性脑缺血组中,谷氨酸浓度出现了更明显的升高。升高出现于缺血的开始,并且迅速升高至基础值的7倍左右,在恢复血流灌注后则迅速下降,于4 min左右回降至基础水平。在CIP+损伤性缺血组,谷氨酸在8 min缺血时升高达到的最高浓度为基础值的3.9倍,表示损伤性缺血引起的高浓度的谷氨酸释放可以被CIP处理明显抑制。在sham, CIP和损伤性缺血组天冬氨酸浓度的变化趋势和谷氨酸的相似。但在CIP+损伤性缺血组、AS-ODNs+CIP+损伤性缺血组和sense-ODNs+CIP+损伤性缺血组,天冬氨酸浓度的峰值分别是基础水平的5、4.3和5.2倍,与损伤性缺血组相比差异无显著性。提示不论是GLT-1a AS-ODNs还是sense-ODNs都对损伤性缺血引起的天冬氨酸浓度变化没有影响。GABA浓度的基础值在各组之间无差异。在sham组,当环绕颈总动脉的线被抽出时其浓度没有显著变化。CIP时GABA浓度有个轻微升高,达基础水平的3.5倍。在损伤性缺血组出现了一个GABA浓度的显著升高,此变化开始于缺血初,迅速达基础值的8倍,在恢复血流灌注后4 min内降至基础水平。CIP+损伤性缺血组中, GABA浓度的峰值达到基础值的21倍,CIP预处理在损伤性缺血时引起了一个更明显的升高。与CIP+损伤性缺血组相比,GABA浓度在AS-ODNs+CIP+损伤性缺血组和sense-ODNs+CIP+损伤性缺血组都没有明显变化。提示短时间和相对长时间的缺血刺激都可以引起GABA浓度的升高,而GLT-1a AS-ODNs和sense -ODNs都对这个升高没有影响。以上结果表明,CIP可以抑制损伤性脑缺血引起的谷氨酸浓度的升高,GLT-1a AS-ODNs阻断了CIP的上述作用,说明CIP后GLT-1a的表达升高能增强谷氨酸的摄取能力而发挥神经保护作用;脑缺血时天冬氨酸也升高,CIP对其无影响;CIP使GABA浓度出现了一个比缺血时更明显的升高而发挥神经保护作用。4 GLT-1a AS-ODNs抑制CIP所诱导的脑缺血耐受鉴于侧脑室给予GLT-1a AS-ODNs后出现了运动行为的轻微变化和透析液中谷氨酸基础浓度的轻度升高,提示此药物本身具有一定的毒理作用,所以我们观察了它本身对海马CA1区锥体神经元的影响;另外为了对应观察各个探针的定位以及氨基酸变化与DND之间的关系,所以第三部分的各组,在微透析实验结束后,移去颈总动脉的环绕线,将动物回笼饲养,7天后取脑组织,制作成石蜡切片,硫堇染色行神经病理学评价。再追加设计了三组（每组n=5）实验,wistar大鼠30只,动物处理同第三部分即于右侧颅骨提前5天埋置双管,分组如下:（7） ACSF+sham组:动物在sham手术前（即抽出环绕线）2 d、1 d和后0 d、1 d注射ACSF入侧脑室（15μl）;（8） GLT-1a AS-ODNs+sham组:由GLT-1a AS-ODNs溶液代替ACSF注射,其余程序与ACSF+sham组相同;（9） GLT-1a AS-ODNs+CIP组:动物在CIP前2 d、1 d和后0 d、1 d注射GLT-1a AS-ODNs入侧脑室,其余步骤同ACSF+sham组。此三组同样于末次手术后,取脑组织,进行神经病理学评价。结果:无论是AS-ODNs+sham还是AS-ODNs+CIP组都未看到锥体神经元出现明显的DND。此两组的组织学分级都与sham和ACSF+sham组相似。此结果提示单纯AS-ODNs不会导致海马CA1区神经元的死亡。在AS-ODNs+CIP+损伤性缺血组中给予AS-ODNs可以取消CIP对抗DND的神经保护作用,表现为严重的锥体神经元的缺失、HG升高和ND减少,这些都与损伤性缺血组非常接近。然而,在S-ODNs+CIP+损伤性缺血组,给予S-ODNs对CIP的神经保护作用无影响,无论是组织形态还是HG和ND值都接近CIP+损伤性缺血组。以上结果与微透析的结果中AS-ODNs对谷氨酸和天冬氨酸浓度的影响一致。给予AS-ODNs对抗了CIP对损伤性缺血导致的谷氨酸和天冬氨酸浓度升高的抑制作用。以上结果表明,GLT-1a AS-ODNs阻断了CIP的脑保护作用。结论1 CIP可上调GLT-1a的表达,其峰值位于1d时间点。损伤性缺血引起GLT-1a表达下调,并伴随着海马CA1区锥体神经元的DND。CIP可以对抗损伤性缺血引起的GLT-1a表达下调和DND,提示GLT-1a参与了脑缺血耐受。2通过对设计的GLT-1a AS-ODNs进行筛选和验证,确定P2链可以成功抑制GLT-1a的表达。此抑制作用可发生在mRNA和蛋白水平,其效应至少可以持续到CIP后5天,且具有剂量依赖性。3微透析实验证实损伤性缺血可以引起谷氨酸浓度迅速升高,CIP可使谷氨酸浓度降低,说明CIP可以通过防止缺血时谷氨酸浓度升高继而降低其兴奋性神经毒性。GLT-1a AS-ODNs侧脑室注射取消了CIP的脑缺血保护作用。天冬氨酸在缺血时的变化类似于谷氨酸,但CIP和GLT-1a AS-ODNs均未对损伤性缺血时天冬氨酸浓度的变化造成影响。γ-GABA在缺血时浓度明显迅速生高,CIP使其浓度进一步升高,GLT-1a AS-ODNs对GABA浓度无影响。4硫堇染色可见GLT-1a AS-ODNs对正常和CIP大鼠的海马CA1区锥体神经元无明显影响。但却可以取消CIP对损伤性缺血导致的DND的保护作用,此结果与微透析部分的实验一致,进一步验证了GLT-1a确实参与了脑缺血耐受。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 英文缩写
• 引言
• 第一部分 GLT-1a 在CIP 诱导的脑缺血耐受中表达的变化
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 第二部分 GLT-1a 的反义脱氧寡核苷酸（antisense oligodeoxynucleotides,AS-ODNs）的设计和对CIP 上调GLT-1a 表达的抑制作用
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 第三部分 GLT-1a AS-ODNs 对脑缺血耐受大鼠海马CA1 区脑透析液中氨基酸浓度的影响
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 第四部分 GLT-1a AS-ODNs 抑制CIP 所致的脑缺血耐受
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 结论
• 综述
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历