鹅HSD3B1基因编码区克隆、序列分析及其在卵泡中的功能初探

论文摘要

3β-羟基类固醇脱氢酶1（3beta-hydroxysteroid dehydrogenasel, HSD3B1）是类固醇激素合成过程中至关重要的酶。它主要催化△5-3β-羟基类固醇（孕烯醇酮、17-羟孕烯醇酮、去氢表雄酮和雄烯二醇）脱氢转变为△4-3-酮基类固醇（孕酮、17-羟孕酮、雄烯二酮和睾酮）。经过这种脱氢化反应后,类固醇由没有活性或者活性较低转化为活性很高的类固醇激素。然而HSD3B1在鹅卵泡发育中的作用及其与类固醇激素含量变化的关系缺乏系统的研究,此外,卵黄中的类固醇激素含量对于卵泡及卵子的发育具有重要作用。本实验以四川白鹅为研究对象,采用RT-PCR方法扩增鹅HSD3B1的CDS （coding domain sequence,编码区序列）并进行生物信息学分析；然后运用qRT-PCR技术研究了HSD3B1在四川白鹅不等发育卵泡中的表达变化；通过竞争放射免疫法测定了小卵泡（直径3-10mm）的每1mm直径差卵泡之间类固醇激素含量以及等级卵泡（F5、F4、F3、F2、F1）的激素含量变化,并对HSD3B1基因表达与类固醇激素变化的关系做了初步分析。研究结果如下：（1）鹅HSD3B1基因的CDS区全长1134bp,编码377个氨基酸。同源性分析表明,鹅HSD3B1序列与其它鸟类相似性高,与哺乳动物较低。鹅HSD3B1有1个保守结构域（3Beta-HSD）,该结构域含284个氨基酸。（2）雌二醇在（4-5mm）达到整个卵泡发育期的最高值,紧接着下降,直到（9-10mm）之间,没有过大的变化,在进入等级卵泡F5的时候,急剧上升,达（4.572±1.147）（P<0.05）,然后雌二醇下降到较低水平并维持到排卵卵泡。孕酮在3-10mm含量极低,而在卵泡进入F1的时候开始上升,然后在F4有所下降,而在F3显著上升,最后到排卵前卵泡的时候达到最高值。睾酮在小卵泡中含量维持不变,而进入等级卵泡F4的过程中急剧上升。随后随卵泡发育到F1的过程中,呈先下降后上升的趋势。（3） HSD3B1基因在组织中表达量从高到低为：卵巢>下丘脑>输卵管>肝脏>垂体（4） HSD3B1mRNA在卵泡（5-6mm）表达量上升达第一个峰,在（6-7mm）时,达到最低点,接着又有一个轻微的回升,在7-8mm时,上升达到（0.00272±0.00285）,此后mRNA表达量开始缓慢下降,到9-10mm时,表达量达到整个卵泡发育期的最低值,此后mRNA表达量又开始上升直到F2达到最大值（0.00873±0.00489）（P<0.05）,而在排卵前卵泡Fl的表达量有所下降。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 常用词语英文缩写
• 前言
• 1 文献综述
• 1.1 类固醇激素在禽类卵泡发育中的作用
• 1.1.1 禽类卵泡发育特点
• 1.1.2 类固醇激素与禽类卵泡发育
• 1.2 HSD3B1基因的功能及表达调控
• 1.2.1 HSD3B1基因结构与功能
• 1.2.2 HSD3B1基因表达部位与亚细胞定位
• 1.2.3 HSD3B1基因表达调控
• 1.3 HSD3B1基因在卵泡类固醇激素合成中的作用
• 1.3.1 类固醇激素合成通路简介
• 1.3.2 禽类卵泡类固醇激素合成的三细胞模式
• 1.4 本研究的目的与意义
• 2. 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验动物处理
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 试剂盒
• 2.1.4 主要仪器设备
• 2.1.5 主要试剂及配制
• 2.1.6 应用的生物学软件
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 HSD3B1基因PCR扩增引物的设计与合成
• 2.2.2 总RNA的提取
• 2.2.3 总RNA的检测
• 2.2.4 反转录PCR
• 2.2.5 PCR扩增反应
• 2.2.6 DNA片段的克隆测序
• 2.2.7 实时荧光定量PCR
• 2.2.8 荧光定量PCR数据统计分析
• 2.2.9 激素的测定
• 2.3 数据处理
• 2.3.1 实时荧光定量PCR数据处理
• 2.3.2 类固醇激素测定数据的处理
• 3 结果与分析
• 3.1 HSD3B1基因CDS区的扩增及分析
• 3.1.1 卵巢组织总RNA的提取
• 3.1.2 HSD3B1反转录扩增
• 3.1.3 HSD3B1基因序列分析
• 3.2 鹅不同等级卵泡中激素含量的变化
• 3.2.1 卵黄雌二醇含量及变化
• 3.2.2 卵黄孕酮含量及变化
• 3.2.3 卵黄睾酮含量及变化情况
• 3.3 HSD3B1在鹅不同等级卵泡及组织中的表达
• 3.3.1 HSD3B1在鹅中的组织差异表达
• 3.3.2. HSD3B1基因在鹅不同等级卵泡的差异表达
• 4. 讨论
• 4.1 鹅HSD3B1的结构
• 4.2 鹅HSD3B1的组织差异表达分析
• 4.3 类固醇激素与卵泡发育的关系分析
• 4.4 HSD3B1在卵泡类固醇激素合成中的分析
• 4.5 存在的问题及展望
• 5. 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录