甲型H1N1流感病毒（2009）HA蛋白的原核表达及酶免检测研究

论文摘要

2009年春季,一种新型甲型H1N1流感病毒,在短时间内迅速蔓延至全球,给人类的生命健康造成了极大的威胁,给各国带来了巨大的经济损失。本研究立项之初,国内外暂无针对此次甲型H1N1流感（2009）的商品化试剂盒,人群对此新型流感病毒普遍易感。因此,建立一种方便、快捷、灵敏的检测方法对于尽早地作出诊断和治疗、防止疫情的大流行具有重大意义。根据病毒核蛋白和基质蛋白抗原性的不同,流感病毒可以分为甲、乙、丙三型。甲型流感病毒根据其表面糖蛋白血凝素（Hemagglutinin,HA）和神经氨酸酶的不同,又可以分为各种亚型。甲型流感病毒的8个基因节段共编码11种蛋白,其中第4节段RNA编码的HA蛋白是病毒表面最主要的糖蛋白,具有较强的免疫原性,可以激发体液免疫和细胞免疫,诱导机体产生针对流感病毒的中和抗体,是决定病毒毒力的主要因素。为了给甲型H1N1流感（2009）的及早诊断和防治提供依据,本论文选择HA蛋白作为研究对象,采用原核表达系统表达目的蛋白,将由其免疫获得的单抗用于甲型H1N1流感病毒（2009）酶免检测方法的探索。主要的研究内容由两部分组成:1. HA抗原的表达:根据GenBank公布的甲型H1N1流感病毒（2009）血凝素基因序列,人工合成HA基因,构建原核表达载体pET-30 Xa/LIC-HA。阳性质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,在37℃,0.1mM IPTG条件下诱导表达。重组蛋白采用镍离子亲和层析法进行纯化。对表达产物进行SDS-PAGE分析和Western blot检测。结果表明,HA基因获得表达,产物以包涵体形式存在,相对分子量约62kD,具有较好的免疫反应性。2.甲型H1N1流感（2009）双抗体夹心检测方法的初步建立:以基因工程表达的HA重组蛋白作免疫原制备单抗,选择其中的两株配对单抗建立甲型H1N1流感病毒（2009）HA抗原双抗体夹心ELISA法,并对该方法的特异性、灵敏度、精密性和稳定性进行评估。结果表明,该方法能特异性地检出甲型H1N1流感病毒（2009）,而与H1N2、H3N2、H5N1和乙型流感病毒无交叉反应;对HA抗原的最低检出限达到1ng/mL,且具有较好的精密性和稳定性。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语
• 第一章 引言
• 1.1 流感病毒概述
• 1.1.1 病原学
• 1.1.2 主要的免疫原性蛋白
• 1.1.3 流感病毒的抗原变异
• 1.2 甲型H1N1 流感病毒（2009）概述
• 1.2.1 流行病学
• 1.2.2 病原学
• 1.2.3 抗原特征
• 1.3 流感病毒血凝素蛋白的研究进展
• 1.4 流感检测方法研究进展
• 1.4.1 传统的检测方法
• 1.4.2 分子生物学诊断技术
• 1.5 甲型H1N1 流感病毒（2009）的检测
• 1.6 本研究的目的和意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株
• 2.1.2 载体
• 2.1.3 主要仪器与设备
• 2.1.4 主要试剂
• 2.1.5 主要溶液的配制
• 2.2 方法
• 2.2.1 构建甲型H1N1 流感病毒（2009）HA 重组质粒
• 2.2.2 HA 蛋白的原核表达、纯化及鉴定
• 2.2.3 甲型H1N1 流感病毒（2009）双抗体夹心检测方法的初步建立
• 第三章 结果
• 3.1 构建甲型H1N1 流感病毒（2009）HA 重组质粒
• 3.1.1 甲型H1N1 流感病毒（2009）HA 全长基因的设计、合成
• 3.1.2 重组质粒的双酶切鉴定
• 3.1.3 测序
• 3.2 HA 蛋白的原核表达、纯化及鉴定
• 3.2.1 原核表达产物的电泳结果
• 3.2.2 重组蛋白的Western Blot 鉴定
• 3.2.3 重组蛋白的纯化
• 3.3 甲型H1N1 流感病毒（2009）双抗体夹心检测方法的初步建立
• 3.3.1 质控品的建立
• 3.3.2 包被抗体与酶标抗体最佳工作浓度的确定
• 3.3.3 包被条件的优化
• 3.3.4 酶标稀释液的配制
• 3.3.5 显色反应系统的研究
• 3.3.6 试剂反应时间的优化
• 3.3.7 特异性
• 3.3.8 灵敏度
• 3.3.9 精密性
• 3.3.10 对临床标本的检测及考核
• 3.3.11 稳定性
• 第四章 讨论
• 4.1 目的基因的选择
• 4.2 载体的选择和纯化条件的摸索
• 4.3 甲型H1N1 流感病毒（2009）双抗体夹心ELISA 法的建立
• 4.4 展望
• 第五章 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文目录