酶法合成色氨酸和非天然氨基酸及其催化机理研究

论文摘要

氨基酸是一类具有生物活性手性分子,氨基酸及其衍生物在医药、食品领域有非常广泛应用,具有很大市场需求,由于氨基酸及其衍生物具有重要应用价值成为氨基酸领域研究热点。氨基酸及其衍生物制备方法有生物法、化学法和物理法等,生物法是利用微生物或酶直接转化,生物法合成与化学法合成相比,具有高效、环保、安全和适合大规模生产等优点。本论文正是基于以上背景开展了系列相关工作,构建基因工程菌生物合成了一系列手性氨基酸中间体,丰富了生物法制备手性药物中间体的研究。具体工作如下:1.trpBA和trpA是L-色氨酸合成途径两个关键酶基因,采用PCR方法从大肠杆菌K-12菌株基因组DNA中扩增到trpBA和trpA基因,将trpBA和trpA基因串联在质粒pETDuet-1上导入大肠杆菌中表达。结果表明,酶法最佳转化条件为:反应温度为35 ℃,pH值为8,底物L-丝氨酸浓度为100 mmol/L,在此条件下酶促反应6 h,L-丝氨酸转化率可达81%,trpBA和trpA基因串联表达宿主细胞酶活高于trpBA单独表达宿主细胞酶活。2.在水/有机溶剂双相体系中,利用重组大肠杆菌色氨酸合成酶催化L-丝氨酸和吲哚合成L-色氨酸。考察了不同有机溶剂、有机相乙酸乙酯体积分数、反应温度、水相pH、底物L-丝氨酸与吲哚摩尔比、底物L-丝氨酸浓度、表面活性剂和酶添加量对色氨酸合成酶酶活的影响。结果表明,酶法最佳转化条件为:有机相溶剂为乙酸乙酯,乙酸乙酯体积分数为2.5%,反应温度为35℃,水相pH为8,底物L-丝氨酸与吲噪摩尔比为1:1.2,底物L-丝氨酸浓度为100 mmol/L,吐温80质量分数为0.4%,单位体积反应介质中酶的添加量为20 g/L。在此条件下酶促反应2.5 h,L-丝氨酸摩尔转化率达95%。色氨酸合成酶空间构象研究表明,吲哚与色氨酸合成酶活性位点Asp138形成了稳定的氢键。利用色氨酸合成酶催化L-丝氨酸和2-甲基吲哚合成2-甲基-L-色氨酸,结果表明,酶法最佳转化条件为:有机相溶剂为甲苯,甲苯体积分数为2%,反应温度为40 ℃,水相pH为8,底物L-丝氨酸与吲哚摩尔比为1:1.2,底物L-丝氨酸浓度为150 mmol/L,表面活性剂Trion X-100质量分数为2%,金属离子Ca2+浓度为0.1 mmol/L,酶促反应5 h,L-丝氨酸摩尔转化率达97.5%。色氨酸合成酶空间构象研究表明,2-甲基吲哚与色氨酸合成酶活性位点Gly189形成了稳定的氢键。3.研究了多羟基化合物聚乙二醇PEG1000、聚乙二醇PEG2000、丙三醇、乙二醇对色氨酸合成酶催化活性影响及其动力学,研究结果表明PEG2000对色氨酸合成酶催化活性具有促进作用,在添加10 g L-1 PEG 2000、pH 9和40 ℃反应条件下,底物L-丝氨酸浓度为100mmol L-1反应2h后转化达到平衡,色氨酸合成酶酶促反应动力学常数分别为Vmax 0.314 mmol min-1 per-1 g-1、Km 1.386 mM、Kcat 23.6 s-1 和KcatKm 17.OmM-1 s-1。4.利用重组色氨酸合成酶催化合成L-半胱氨酸、S-甲基-L-半胱氨酸、S-羧甲基-L-半胱氨酸和S-苯基-L-半胱氨酸。考察了底物特异性、反应温度、pH、底物浓度、底物摩尔比和反应时间对色氨酸合成酶酶活影响。结果表明,色氨酸合成酶以硫氢化钠和甲硫醇为底物时活性显著高于苯硫酚和巯基乙酸为底物时活性,四种底物酶法最佳转化条件为:反应温度为37 ℃,pH为8,L-丝氨酸与硫氢化钠、甲硫醇、苯硫酚或巯基乙酸的适宜底物摩尔比为1:1.2,底物最适合浓度为400mmol/L,硫氢化钠、甲硫醇、苯硫酚和巯基乙酸反应达到平衡时间分别为8 h、12 h、16 h和18 h,底物L-丝氨酸摩尔转化率均达到90%以上,硫氢化钠与色氨酸合成酶活性位点Ser235形成稳定的氢键,甲硫醇与色氨酸合成酶活性位点Gly234形成稳定的氢键,苯硫醇与色氨酸合成酶活性位点Ser235和Gly233形成稳定的氢键,疏基乙酸与色氨酸合成酶活性位点Gly232、Gly233、Gly234、Ser235和Asn236形成稳定的氢键。5.利用N-乙酰鸟氨酸脱乙酰酶拆分N-乙酰-D,L-色氨酸、N-乙酰-D,L-苯丙氨酸和N-乙酰-D,L-蛋氨酸,该酶促反应最适条件:pH7.0,反应温度为45℃时,表面活性剂吐温-800.4%,Co2+浓度为10-4mol/L,反应时间为5h,N-乙酰鸟氨酸脱乙酰酶拆分300mmol/L N-乙酰-DL-氨基酸能力依次为N-乙酰-DL-蛋氨酸、N-乙酰-D,L-苯丙氨酸和N-乙酰-D,L-色氨酸,N-乙酰-DL-蛋氨酸、N-乙酰-D,L-苯丙氨酸和N-乙酰-D,L-色氨酸摩尔转化率分别为96%、83%和65%。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 手性药物研究意义
• 1.2 手性药物制备方法
• 1.2.1 手性药物生物合成
• 1.2.2 手性药物化学合成
• 1.2.3 手性药物色谱拆分
• 1.2.4 手性药物膜拆分
• 1.3 生物技术在手性药物合成中应用
• 1.3.1 酶拆分外消旋体法合成手性药物
• 1.3.2 酶法不对称合成手性药物
• 1.3.3 微生物发酵法合成手性药物
• 1.3.4 手性药物生物合成方法改进
• 1.4 酶工程技术在氨基酸生产领域应用
• 1.4.1 酶法氨基酸生产概况
• 1.4.2 我国酶法制备氨基酸进展
• 1.5 氨基酸代谢酶研究
• 1.5.1 色氨酸合成酶性质
• 1.5.2 色氨酸合成酶应用
• 1.5.3 N-乙酰鸟氨酸脱乙酰酶性质
• 1.5.4 N-乙酰鸟氨酸脱乙酰酶应用
• 1.6 添加剂对酶促反应影响
• 1.6.1 有机溶剂影响
• 1.6.2 多醇类化合物影响
• 1.6.3 表面活性剂影响
• 1.7 选题目的和意义
• 参考文献
• 第二章 串联表达trpBA和trpA色氨酸合成酶基因工程菌构建及应用
• 1.1 引言
• 1.2 实验材料
• 1.2.1 菌株和质粒
• 1.2.2 酶和试剂
• 1.2.3 主要实验仪器
• 1.2.4 培养基
• 1.3 实验方法
• 1.3.1 引物设计
• 1.3.2 E. coli K-12基因组DNA提取
• 1.3.3 PCR扩增
• 1.3.4 PCR产物纯化
• 1.3.5 质粒pETDuet-1提取
• 1.3.6 目的基因和载体双酶切
• 1.3.7 酶切产物纯化
• 1.3.8 连接反应
• 1.3.9 连接产物转化
• 1.3.10 重组质粒双酶切验证
• 1.3.11 色氨酸合成酶工程菌诱导表达
• 1.3.12 质粒pETDuet-1提取
• 1.3.13 目的基因和载体双酶切
• 1.3.14 酶切产物纯化
• 1.3.15 连接反应
• 1.3.16 连接产物转化
• 1.3.17 重组质粒双酶切验证
• 1.3.18 色氨酸合成酶工程菌诱导表达
• 1.3.19 色氨酸合成酶活性测定
• 1.3.20 酶转化液丙酮酸测定
• 1.4 实验结果
• 1.4.1 trp BA和trpA基因的PCR扩增及相关重组质粒构建
• 1.4.2 基因序列测定
• 1.4.3 SDS-PAGE蛋白电泳检测基因表达产物
• 1.4.4 反应温度对酶活影响
• 1.4.5 pH对酶活影响
• 1.4.6 底物浓度对酶活影响
• 1.4.7 酶促反应进程
• 1.4.8 氨基酸分析仪测定
• 1.5 结论与讨论
• 参考文献
• 第三章 水/有机溶剂双相体系中色氨酸合成酶酶法合成L-色氨酸及其衍生物
• 第一节 水/有机溶剂双相体系中色氨酸合成酶酶法合成L-色氨酸
• 1.1 引言
• 1.2 实验部分
• 1.2.1 菌体培养
• 1.2.2 酶法合成L-色氨酸及酶活测定
• 1.3 结果与讨论
• 1.3.1 有机溶剂影响
• 1.3.2 有机溶剂体积分数影响
• 1.3.3 反应温度影响
• 1.3.4 水相pH影响
• 1.3.5 底物摩尔比对酶活影响
• 1.3.6 底物浓度对酶活影响
• 1.3.7 表面活性剂对酶活影响
• 1.3.8 酶添加量对反应速率影响
• 1.3.9 酶促反应进程
• 1.4 结论
• 参考文献
• 第二节 水/有机溶剂双相体系中色氨酸合成酶酶法合成2-甲基-L-色氨酸
• 1.1 引言
• 1.2 实验部分
• 1.2.1 菌体培养
• 1.2.2 酶法合成L-2-甲基色氨酸及酶活测定
• 1.3 结果与讨论
• 1.3.1 有机溶剂影响
• 1.3.2 有机溶剂体积分数影响
• 1.3.3 反应温度和pH影响
• 1.3.4 底物浓度对酶活影响
• 1.3.5 表面活性剂对酶影响
• 1.3.6 金属离子对酶活影响
• 1.3.7 酶促反应进程
• 1.4 结论
• 参考文献
• 第四章 多羟基化合物对色氨酸合成酶催化活性影响及其动力学研究
• 1.1 引言
• 1.2 材料与方法
• 1.2.1 试剂与仪器
• 1.2.2 菌体培养
• 1.2.3 酶法合成L-色氨酸及酶活测定
• 1.3 结果与讨论
• 1.3.1 多羟基化合物对色氨酸合成酶活性影响
• 1.3.2 反应温度和pH对酶活影响
• 1.3.3 底物浓度对酶活影响
• 1.3.4 酶促反应进程
• 1.3.5 酶促反应动力学常数测定
• 1.4 小结
• 参考文献
• 第五章 色氨酸合成酶催化合成L-半胱氨酸及其衍生物研究
• 1.1 引言
• 1.2 材料与方法
• 1.2.1 试剂与仪器
• 1.2.2 菌体培养
• 1.2.3 色氨酸合成酶底物特异性测定
• 1.2.4 酶促反应条件优化
• 1.2.5 酶活力测定
• 1.3 结果与讨论
• 1.3.1 色氨酸合成酶底物特异性
• 1.3.2 pH对酶活性影响
• 1.3.3 温度对酶活性影响
• 1.3.4 底物摩尔比对反应影响
• 1.3.5 底物浓度对反应影响
• 1.3.6 反应时间进程
• 1.3.7 半胱氨酸及其衍生物制备
• 1.4 小结
• 参考文献
• 第六章 N-乙酰鸟氨酸脱乙酰酶拆分N-乙酰-D,L-氨基酸
• 1.1 引言
• 1.2 材料与方法
• 1.2.1 实验材料
• 1.2.2 实验方法
• 1.3 结果与讨论
• 1.3.1 pH值对酶促反应影响
• 1.3.2 温度对酶促反应影响
• 1.3.3 表面活性剂对酶促反应影响
• 1.3.4 金属离子对酶促反应影响
• 1.3.5 底物浓度对酶促反应影响
• 1.3.6 酶促反应时间动态变化
• 1.4 结论
• 参考文献
• 第七章 总结与展望
• 主要结论
• 前景展望
• 攻读博士学位期间发表论文与申请专利
• 1H-NMR（500MHz,D₂O）'>附图1 L-色氨酸¹H-NMR（500MHz,D₂O）
• 附图2 L-色氨酸质谱图
• 1H-NMR（500MHz,D20）'>附图3 L-胱氨酸¹H-NMR（500MHz,D20）
• 附图4 L-胱氨酸质谱图
• 致谢