基于磁球放大技术的电化学发光免疫分析研究

论文摘要

论文的第一章研究了三联吡啶钌的N-羟基琥珀酰亚胺酯（Ru（bpy）2（dcbpy）NHS）修饰磁球的构建及其电化学发光（ECL）。首先合成了Ru（bpy）2（dcbpy）NHS并用红外光谱，紫外光谱，荧光光谱等方法对其进行了表征。然后利用线性扫描伏安法对Ru（bpy）2（dcbpy）NHS进行了ECL检测，ECL曲线的峰电位为1．25 V。采集到Ru（bpy）2（dcbpy）NHS ECL的光谱图，峰值在672 nm处。其ECL强度与同浓度的Ru（bpy）3Cl2溶液的ECL强度相当。然后构建了Ru（bpy）2（dcbpy）NHS修饰的生物素包被的磁球（Bio-磁球）及链霉亲和素包被的磁球（SA-磁球）。利用Ru（bpy）2（dcbpy）NHS上的酰基与链霉亲和素（SA）上的氨基发生偶联发应形成酰胺键，得到SA修饰的Ru（bpy）2（dcbpy）NHS（Ru（bpy）2（dcbpy）NHS-SA）。利用生物素与SA的特异性反应，将Bio-磁球与Ru（bpy）2（dcbpy）NHS-SA连接在一起，得到Ru（bpy）2（dcbpy）NHS修饰的Bio-磁球。Ru（bpy）2（dcbpy）NHS修饰SA-磁球的构建利用了磁球上SA的伯胺与Ru（bpy）2（dcbpy）NHS上的酯基反应形成酰胺键使Ru（bpy）2（dcbpy）NHS直接与磁球结合。结果表明，Ru（bpy）2（dcbpy）NHS修饰的这两种磁球可以产生较强的ECL。论文的第二章提出了一种新的提高电化学发光免疫分析（ECLIA）灵敏度的方法：基于磁球放大技术的ECLIA方法。在此方法中，我们利用小鼠抗人CA125抗体上的氨基与硅烷化基底上的环氧基的反应将小鼠抗人CA125抗体固定在基底表面。经双抗夹心免疫反应，生物素与SA的特异性反应等形成磁球-抗体-目标抗原-抗体夹心复合体，然后将过量Ru（bpy）2（dcbpy）NHS-SA与固定在基底上的磁球复合体进行反应，形成了Ru（bpy）2（dcbpy）NHS标记的磁球复合体，然后进行ECL检测。由于一个磁球上结合了大量的Ru（bpy）2（dcbpy）NHS，提高了电化学发光效率，从而提高了方法的灵敏度。本章还优化了实验条件（如BSA封闭时间，抗原抗体孵育浓度及孵育时间等）。在最佳条件下，实现了对人卵巢癌抗原CA125的定量测定，该方法的线性浓度范围为5．00×10-9mol／L～1．00×10-7mol／L。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 符号说明
• 第一章 三联吡啶钌N-羟基琥珀酰亚胺酯的合成与表征及其包被磁球的电化学发光研究
• 1.1 引言
• 1.2 实验部分
• 1.2.1 仪器
• 1.2.2 材料与试剂
• 1.2.3 实验步骤
• 1.2.3.1 电解池的制作
• 1.2.3.2三联吡啶钌的N-羟基琥珀酰亚胺酯的合成
• 2（dcbpy）NHS的表征'>1.2.3.3 Ru（bpy）₂（dcbpy）NHS的表征
• 1.2.3.3.1 红外光谱表征
• 1.2.3.3.2 紫外-可见光谱表征
• 1.2.3.3.3 荧光光谱表征
• 1.2.3.3.4 电化学发光检测
• 1.2.3.4 磁球的预处理
• 1.2.3.5 三联吡啶钌的N-羟基琥珀酰亚胺酯修饰磁球的构建及其电化学发光
• 2（dcbpy）NHS修饰Bio-磁球的构建'>1.2.3.5.1 Ru（bpy）₂（dcbpy）NHS修饰Bio-磁球的构建
• 2（dcbpy）NHS修饰SA-磁球的构建'>1.2.3.5.2 Ru（bpy）₂（dcbpy）NHS修饰SA-磁球的构建
• 1.3 结果与讨论
• 1.3.1 三联吡啶钌/三丙胺体系电化学发光反应原理
• 1.3.2 三联吡啶钌的N-羟琥珀酰亚胺酯的合成
• 1.3.3 三联吡啶钌的N-羟琥珀酰亚胺酯的表征
• 1.3.3.1 红外光谱表征
• 1.3.3.2 紫外-可见光谱表征
• 1.3.3.3 荧光特性
• 1.3.3.4 电化学发光
• 2（dcbpy）NHS修饰磁球的构建及其电化学发光'>1.3.3.5 Ru（bpy）₂（dcbpy）NHS修饰磁球的构建及其电化学发光
• 2（dcbpy）NHS修饰Bio-磁球的构建及其电化学发光'>1.3.3.5.1 Ru（bpy）₂（dcbpy）NHS修饰Bio-磁球的构建及其电化学发光
• 2（dcbpy）NHS修饰SA-磁球的构建及其电化学发光'>1.3.3.5.2 Ru（bpy）₂（dcbpy）NHS修饰SA-磁球的构建及其电化学发光
• 1.4 结论
• 1.5 参考文献
• 第二章 基于磁球放大技术的电化学发光免疫分析法检测肿瘤相关抗原CA125
• 2.1 引言
• 2.2 实验部分
• 2.2.1 仪器
• 2.2.2 材料与试剂
• 2.2.3 实验步骤
• 2.2.3.1 高压灭菌
• 2.2.3.2 保湿盒的制作
• 2.2.3.3 载体的硅烷化
• 2.2.3.3.1 ITO导电玻璃的预处理
• 2.2.3.3.2 盖玻片的预处理
• 2.2.3.3.3 ITO导电玻璃和盖玻片的硅烷化
• 2.2.3.4 链霉亲和素修饰的三联吡啶钌的N-羟基琥珀酰亚胺酯的合成
• 2.2.3.5 微池的制作
• 2.2.3.6 双抗夹心免疫反应过程
• 2.2.3.7 落射荧光显微术
• 2.2.3.8 电化学发光检测
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 小鼠抗人CA125抗体固定在硅烷化的盖玻片上的最佳时间的选择
• 2.3.2 BSA封闭液的最佳封闭时间
• 2.3.3 小鼠抗人CA125单克隆抗体与抗原的最佳孵育时间的选择
• 2.3.4 生物素化兔抗人CA125多克隆抗体与抗原结合的最佳浓度的选择
• 2.3.5 抗原与生物素化兔抗人CA125多克隆抗体最佳孵育时间的选择
• 2.3.6 缓冲液最佳清洗次数的选择
• 2.3.7 检测抗原CA125的线性范围及检测限
• 2.4 结论
• 2.5 参考文献
• 致谢
• 学位论文评阅及答辩情况表