鸡胚成纤维细胞cDNA文库的构建及抑制IBDV感染CEF的mAb的制备

论文摘要

传染性法氏囊病毒（infectious bursal disease virus, IBDV）是引起鸡传染性法氏囊病（infectious bursal disease, IBD）的病原体,主要侵害3～6周龄雏鸡中枢免疫器官-法氏囊,感染并诱导PreB细胞凋亡,引起严重的免疫抑制,导致免疫失败和对其它传染病易感性增加,对养鸡业造成重大损失。IBDV强毒株经过CEF或Vero细胞盲传数代,可获得适应细胞培养的致弱株,因此除了鸡的B淋巴细胞之外,CEF和Vero细胞也可能存在不同毒力的IBDV受体及感染相关的分子,介导病毒吸附,侵入等感染的重要过程。为了研究存在于原代鸡胚成纤维细胞（chicken embryo fibroblast, CEF）的IBDV受体等感染相关的分子,本研究首先构建了鸡胚成纤维细胞cDNA真核表达文库,并建立了高效电转化感受态细胞E. coli strain DH10B制备方法用于文库的扩增。然后将biotin - streptavidin系统用于免疫组化建立了感染阳性细胞数减少试验的方法,用于筛选抑制IBDV感染CEF的单克隆抗体,采用全细胞免疫的方法制备了抑制IBDV感染CEF的单克隆抗体,其中最好的一株平均感染抑制率达到84.5%,且其感染抑制率具有剂量依赖性,另外通过流式细胞仪可以确定该mAb所针对的蛋白存在于CEF表面,由此推测该mAb所针对的蛋白在IBDV感染的过程中起核心作用,该蛋白极有可能就是IBDV受体成分之一,即使不是该病毒的受体也是该病毒感染相关的分子,由于该mAb并不能完全抑制IBDV感染,提示CEF表面还有其它受体的存在;该单克隆抗体的制备为克隆存在于CEF的IBDV受体等感染相关分子的基因,以及揭示IBDV感染机理奠定了基础。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• 文献综述
• 1. 鸡传染性法氏囊病毒的生物学特性
• 2. 病毒细胞受体及感染相关分子
• 2.1 病毒受体及感染相关分子的研究意义
• 2.2 病毒细胞受体及感染相关分子研究的复杂性
• 3.IBDV 细胞受体的研究进展
• 3.1 致病性IBDV 主要感染SIgM 阳性B 淋巴细胞
• 3.2 IBDV 感染不需要鸡B 淋巴细胞表面特异性抗原Bu-1 介导
• 3.3 CEF 和鸡B 淋巴细胞表面IBDV 受体的分布
• 3.4 IBDV 受体在Vero 细胞表面的分布
• 3.5 IBDV 受体是N-连接糖基化的蛋白质
• 引言
• 第一章 鸡胚成纤维细胞cDNA 真核表达文库的构建及鉴定
• 1. 材料与方法
• 1.1 材料、质粒和菌株
• 1.2 方法
• 1.2.1 CEF 的制备和mRNA 提取
• 1.2.2 cDNA 第一链的合成
• 1.2.3 cDNA 双链的合成
• 1.2.4 cDNA 与接头连接
• 1.2.5 cDNA 双链酶切消化和分级分离
• AP311eo 载体'>1.2.6 cDNA 克隆到p^AP311eo载体
• 1.2.7 重组质粒点转转化E.coli strain DH108
• 1.2.8 文库质量评价
• 2. 结果
• 2.1 鸡胚成纤维细胞mRNA 的提取
• 2.2 初始文库的容量大小和插入片段大小的分析
• 3. 讨论
• 4. 小结
• 第二章 高效电转化感受态细胞E.coli strain DH108 的制备方法研究
• 1. 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌种和质粒
• 1.1.2 试剂
• 1.1.3 试剂的配制及保存方法
• 1.1.4 仪器与设备
• 1.2 优化方法步骤
• 1.2.1 准备工作
• 1.2.2 确定生长阶段和最后重悬体积与细胞密度及转化效率的关系
• 1.2.3 洗液对转化效率的影响
• 1.2.4 电击参数的设置比较
• 1.2.5 用某些化学试剂处理细胞对转化效率的影响
• 2. 结果
• 2.1 生长阶段和细胞重悬体积优化
• 2.2 电场强度的优化
• 2.3 洗液、DTT 和DL-threonine 等化学试剂对转化效率的影响
• 2.4 最佳方法步骤
• 3. 讨论
• 4. 小结
• 第三章 抑制IBDV 感染CEF 的单克隆抗体的筛选方法的建立
• 1. 材料
• 1.1 细胞和病毒
• 1.2 培养基及其它试剂
• 2. 方法
• 2.1 CEF 细胞的制备和IBDV 的培养
• 2.2 免疫组化试验中接毒量和接毒时间的优化
• 2.3 抗IBDV 的MAb F22EA6 的初步提纯和Biotin 标记
• 2.4 F22EA6-Biotin 在免疫组化中的工作浓度确定
• 2.5 筛选系统效果评价
• 3. 结果
• 3.1 免疫组化试验中接毒量和接毒时间的优化
• 3.2 F22EA6 的初步提纯和Biotin 标记
• 3.3 F22EA6-Biotin 在免疫组化中的工作浓度
• 3.4 筛选系统效果评价
• 3.5 抑制IBDV 感染CEF 的MAb 的筛选方法步骤
• 4. 讨论
• 5. 小结
• 第四章 抑制IBDV 感染CEF 的单克隆抗体的制备及部分功能鉴定
• 1. 材料
• 1.1 细胞和病毒
• 1.2 培养基及其它试剂
• 1.3 单克隆抗体制备所需溶液
• 1.4 试验动物
• 2. 方法
• 2.1 免疫原的制备和免疫方法
• 2.2 总抗体效价和阻断IBDV 感染的效果测定与比较
• 2.3 抑制IBDV 感染的mAb 杂交瘤细胞株的建立
• 2.3.1 细胞融合所用小鼠的选择
• 2.3.2 细胞融合与阳性杂交瘤细胞株的筛选
• 2.3.2.1 N50 骨髓瘤细胞的准备
• 2.3.2.2 饲养细胞的制备
• 2.3.2.4 融合细胞的培养
• 2.3.2.5 阳性杂交瘤细胞的筛选
• 2.3.2.6 阳性杂交瘤细胞的克隆
• 2.4 抑制IBDV 感染的m Ab 的生产
• 2.4.1 体外培养
• 2.4.2 体内诱生腹水
• 2.5 上清稀释后的梯度抑制试验
• 2.6 用该 mAb 对 CEF 进行表面染色
• 2.7 流式细胞仪检测 mAb 与 CEF 表面分子的结合
• 3.结果
• 3.1 总抗体效价和阻断 IBDV 感染的效果测定与比较
• 3.2 抑制 IBDV 感染的 mAb 杂交瘤细胞株的筛选
• 3.3 38-1 上清稀释后梯度抑制感染试验
• 3.4 用该 mAb 对 CEF 进行表面染色
• 3.5 流式细胞仪检测抗体与 CEF 表面分子的结合
• 4.讨论
• 5.小结
• 参考文献
• 英文摘要