人类锌指蛋白家族新基因ZNF383的克隆与功能研究

论文摘要

在哺乳动物中,锌指蛋白可能是最庞大的转录因子家族。MAPK信号途径在真核细胞信号调控中是最为广泛的机制之一。已知有许多的转录因子是非常重要的MAPK靶基因,锌指蛋白就是中间的一类。为了鉴定控制心脏发育和疾病发生的新基因,我们从心脏cDNA文库中克隆了一个人类锌指蛋白家族新基因,经国际基因命名委员会批准命名为ZNF383。ZNF383全长为2220个碱基,定位于染色体19q13.12.它含有一个长为1428个碱基的开放阅读框,编码一个含475个氨基酸的蛋白质,蛋白质分子量大约为54.6千道而顿。该基因在N端含有一个高度保守的KRAB型结构域,并且在其C端具有11个连续的C2H2型锌指结构单元。Northern杂交结果表明ZNF383在成体和胚胎的大部分组织中都有表达,其中在骨骼肌有较强烈的表达。在COS-7细胞中,ZNF383定位于细胞核和细胞质。当含有ZNF383和GAL4-BD结构域的融合蛋白与VP-16一起转染COS-7细胞时,表现出较强的转录抑制活性。结构域片段分析表明是KRAB框决定了ZNF383的转录抑制活性。ZNF383在COS-7细胞中过表达能激活转录因子AP-1与SRE的活性,结果表明新基因ZNF383可以是MAPK信号转导途径的一个转录抑制子。

论文目录

• 中英文缩写词简表
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• 前言
• 1.引言和文献综述
• 1.1 C2H2型锌指蛋白
• 1.1.1 锌指蛋白基因家族
• 1.1.2 C2H2型锌指蛋白的结构和特征
• 1.1.3 锌指蛋白中的KRAB框
• 1.2 锌指蛋白家族和心脏发育
• 1.3 MAPK信号转导途径
• 1.3.1 MAPK家族
• 1.3.2 MAPK信号途径的功能
• 2.ZNF383基因的克隆、序列特征、表达分析及其功能研究
• 2.1 生物信息学软件
• 2.2 主要材料与试剂
• 2.2.1 主要材料
• 2.2.2 主要实验仪器
• 2.3 ZNF383基因的全长克隆
• 2.3.1 总RNA提取
• 2.3.2 反转录
• 2.3.3 凝胶回收
• 2.3.4 连接实验
• 2.3.5 感受态细胞的制备
• 2.3.6 连接产物的转化
• 2.3.7 重组克隆的筛选和鉴定
• 2.3.8 质粒酶切
• 2.3.9 ZNF383基因ORF的克隆
• 2.3.10 ZNF383 5’RACE的扩增
• 2.4 ZNF383基因的序列特征分析结果
• 2.4.1 ZNF383的cDNA与蛋白质序列特征分析
• 2.4.2 ZNF383与同源基因的进化分析
• 2.5 ZNF383基因的表达分析
• 2.5.1 Northern膜的制备
• 2.5.2 Northern杂交
• 2.5.3 Northern杂交结果分析
• 2.6 ZNF383基因在亚细胞结构中的定位分析
• 2.6.1 EGFP-N1-ZNF383重组质粒构建
• 2.6.2 细胞培养及转染
• 2.6.3 EGFP-N1-ZNF383融合蛋白的亚细胞定位分析35
• 2.7 ZNF383基因的初步功能研究
• 2.7.1 ZNF383的表达报告基因检测
• 2.7.1.1 质粒构建
• 2.7.1.2 表达报告基因检测
• 2.7.2 ZNF383结构域分段研究
• 2.7.2.1 ZNF383结构域片段质粒构建
• 2.7.2.2 ZNF383 结构域片段报告基因表达检测
• 结语
• 参考文献
• 致谢
• 附录
• 附录1
• 附录2