噬菌体聚糖酶及其酶解产物的制备及性质研究

论文摘要

本文从Klebsiella K13及其专一性侵染噬菌体P13出发,对噬菌体P13的聚糖酶进行制备,以此为工具对Klebsiella K13的胞外多糖进行酶解得到酶解产物。并对噬菌体聚糖酶及其酶解产物的性质进行研究。为提高Klebsiella K13胞外多糖产量,使用单因素试验和正交试验,对其胞外多糖液体发酵的培养条件及培养基组成进行了优化,得出最佳培养基组成及培养条件如下:（1）最佳培养基组成为: 10×盐溶液（g/L）:FeSO4.7H2O 0.01,NaCl 10,Na2HPO4100,KH2PO4 30, CaCl2.2H2O 0.01,K2SO4 10, MgSO4.7H2O 2;葡萄糖30g/L,牛肉膏0.5g/L,蛋白胨0.5g/L,油酸1.5g/L。（2）最佳发酵参数为:初始pH7.0,温度24℃,接种量10%,装液量200mL/500mL,培养时间50h。在上述优化培养条件下对Klebsiella K13进行液体发酵,以初始液体发酵培养基为对照,细菌胞外多糖的产量达6.7 g/L,比条件优化前的产量（2.64 g/L）增加了153%。通过对噬菌体P13侵染过程中菌液浓度、效价及酶活测定,确定噬菌体聚糖酶制备的最佳时间为噬菌体P13侵染后120min。利用丙酮提取法对噬菌体聚糖酶进行提取,并对最佳提取条件进行研究,发现添加1.5体积的预冷丙酮时提取效果最好。沉淀所得噬菌体聚糖酶使用100kD超滤离心管进行超滤离心后,采用Q-Sepharose FF柱层析进行初步纯化。以提取和纯化过程中的酶活性及效价变化为指示,分析了每一个提取和纯化步骤的效果,发现经过这些过程,噬菌体聚糖酶基本和杂蛋白分开。以高度专一性侵染Klebsiella K13的噬菌体所分泌的噬菌体聚糖酶为工具,对Klebsiella K13胞外多糖进行降解,得到的酶解产物经Bio-Gel P4凝胶柱及Bio-Gel P6凝胶柱层析进行分离纯化,得到分子量依次增大的P1,P2,P3三个低分子量的组分。通过气相色谱分析对胞外多糖的单糖组分进行分析,发现此胞外多糖由葡萄糖、甘露糖和半乳糖三种单糖组成。借助于ESI-CID-MS分析,确定了各寡糖组分的分子量,并确定各片段分别为五糖、十糖、十五糖。经红外光谱分析,发现寡糖含有糖醛酸等特征官能团。通过一维核磁共振波谱分析和二维核磁共振波谱分析,初步确定了寡糖组分P1的基本结构。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 0 前言
• 0.1 胞外多糖简介
• 0.1.1 胞外多糖的生理功能
• 0.1.2 胞外多糖的生物学活性
• 0.1.3 海洋细菌胞外多糖
• 0.1.4 胞外多糖的合成类型
• 0.1.5 影响EPS 产量的因素
• 0.1.6 胞外多糖开发与应用现状
• 0.2 寡糖
• 0.2.1 寡糖的分类
• 0.2.2 功能性寡糖的生理功能
• 0.2.3 寡糖的提取和制备
• 0.2.4 寡糖的分离
• 0.2.5 寡糖的结构分析方法
• 0.3 噬菌体及其聚糖酶
• 0.3.1 噬菌体简介
• 0.3.2 海洋环境中的噬菌体
• 0.3.3 噬菌体聚糖酶
• 0.4 本课题研究内容、目的及意义
• 参考文献
• 1 克雷伯氏菌胞外多糖液体发酵条件优化
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 实验菌株
• 1.1.2 实验试剂
• 1.1.3 实验仪器
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 培养基
• 1.2.2 种子培养液的制备方法
• 1.2.3 发酵条件的研究
• 1.2.4 发酵液中残糖量测定方法
• 1.2.5 EPS 产量的测定方法
• 1.2.6 培养基的选择和优化
• 1.3 结果与分析
• 1.3.1 最佳培养条件的选择
• 1.3.2 培养基最佳成分的选择
• 1.3.3 正交试验优化培养基组分和培养条件
• 1.3.4 Klebsiella K13 胞外多糖发酵过程曲线
• 1.3.5 验证试验
• 1.4 本章小结
• 参考文献
• 2 噬菌体聚糖酶的制备及研究
• 2.1 材料与仪器
• 2.1.1 试验菌株
• 2.1.2 试验试剂
• 2.1.3 试验仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 试剂及培养基配制
• 2.2.2 噬菌体P13 的富集培养
• 2.2.3 噬菌体P13 的效价测定
• 2.2.4 噬菌体聚糖酶酶活测定
• 2.2.5 噬菌体聚糖酶粗酶液的制备
• 2.2.6 噬菌体聚糖酶的提取
• 2.2.7 噬菌体聚糖酶的超滤离心
• 2.2.8 噬菌体聚糖酶的Q-Sepharose FF 凝胶柱层析纯化
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 噬菌体P13 的富集及效价测定
• 2.3.2 噬菌体P13 侵染过程中各参数变化曲线
• 2.3.3 噬菌体聚糖酶的提取
• 2.3.4 噬菌体聚糖酶的纯化
• 2.4 本章小结
• 参考文献
• 3 噬菌体聚糖酶酶解产物的制备及结构分析
• 3.1 材料与仪器
• 3.1.1 试验材料
• 3.1.2 试验试剂
• 3.1.3 试验仪器
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 酶解产物的制备
• 3.2.2 寡糖的分离纯化
• 3.2.3 寡糖结构测定
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 寡糖的Bio-Gel P4 柱分离纯化
• 3.3.2 寡糖的Bio-Gel P6 柱纯化
• 3.3.3 胞外多糖的单糖组分分析
• 3.3.4 寡糖的红外光谱分析
• 3.3.5 寡糖分子量的测定
• 3.3.6 寡糖的一维核磁共振波谱分析
• 3.3.7 寡糖的二维核磁共振波谱分析
• 3.4 本章小结
• 参考文献
• 4. 论文结论
• 5. 创新点
• 6. 展望
• 致谢
• 个人简历
• 发表的学术论文