人胸苷激酶Ⅰ免疫分析方法研究

论文摘要

利用生物传感器技术检测疾病标志物,进行临床疾病的快速诊断以及流行性疾病的现场筛选与群体监控,是当前医学上既新颖又极具吸引力的热门研究课题之一。人胸苷激酶Ⅰ（ hTK1 ）是一种新的肿瘤标志物,我们就hTK1开展了新型免疫分析方法的研究。这些方法具有快速、准确、方便等优点,而且还避免了放射性免疫方法中经常遇见的问题,有一定的实用价值,有望用于hTK1的临床免疫检测。（1）研制了一种用于hTK1检测的荧光增强型免疫分析方法。采用磁纳米颗粒作为生物分子固定化载体,将辣根过氧化物酶标记的抗体（HRP-Ab）和游离的待测hTK1同时与磁性纳米颗粒表面的固定化hTK1竞争反应。当与磁场分离后,结合在磁性纳米颗粒的酶标记抗体催化3-（间-羟苯基）-丙酸形成荧光产物,在470 nm处产生荧光增强,且荧光增强反比于待测hTK1的浓度。hTK1的线性检测范围为0.01-1 ng/mL,检测下限达到0.008 ng/mL。该荧光免疫方法能很好地检测癌症血清和正常血清中的hTK1,且简单、快速、灵敏,该方法尚可用于其它生物分子的临床检测。（2）研究了一种新型hTK1电流型免疫分析方法。制备了纳米金-壳聚糖复合材料（Nano Au-Chit）,壳聚糖膜表面丰富的-NH2与纳米金强静电结合,在玻碳电极表面获得稳定的纳米金-壳聚糖复合物修饰层,再共价固定hTK1。负电性的纳米金可以有效地保持酶的活性,从而制备了性能良好的电流型hTK1免疫传感器,hTK1检测的线性范围是0.5-10 ng/mL,检测限为0.22 ng/mL,显示了良好的检测灵敏度。（3）建立了一种hTK1显微检测新方法。通过扫描电化学显微镜（SECM）的收集模式,检测辣根过氧化物酶（HRP）催化对苯二酚（ H2Q ）氧化产生的1,4一苯醌（BQ）来间接检测样品中的hTK1。实验中,我们确定了检测hTK1的实验条件,缓冲液为0.1m ol/L磷酸缓冲溶液（ pH7 .0 ）,底物H2Q和H2O2的浓度均为1.0 x 10-3 mol/L,探头电位为- 0.3 V。在这些实验条件下,对固定在金基底上的hTK1点进行了扫描,得到了它的SECM图像。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 免疫分析法概述
• 1.1.1 抗原
• 1.1.2 抗体
• 1.1.3 抗原抗体的免疫反应
• 1.1.4 免疫分析中的抗体位点占据原理
• 1.2 免疫分析法的分类
• 1.2.1 放射性免疫分析法
• 1.2.2 酶免疫分析法
• 1.2.3 化学发光免疫分析法
• 1.2.4 荧光免疫分析
• 1.2.5 电化学免疫分析法
• 1.3 扫描电化学显微镜
• 1.3.1 扫描电化学显微镜及其特点
• 1.3.2 实验装置、工作模式和工作原理
• 1.4 免疫分子固定方法
• 1.4.1 吸附法
• 1.4.2 交联法
• 1.4.3 共价键合法
• 1.4.4 物理包埋法
• 1.5 纳米粒子在免疫分析中的应用
• 1.5.1 纳米金在免疫分析中的应用
• 1.5.2 磁性纳米颗粒在免疫分析中的应用
• 1.6 本论文工作构思
• 1.6.1 基于磁性颗粒的人胸苷激酶荧光免疫分析
• 1.6.2 基于纳米金-壳聚糖复合材料的人胸苷激酶电化学免疫分析
• 1.6.3 利用扫描电化学显微镜测定人胸苷激酶
• 第2章 基于磁性颗粒的人胸苷激酶? 荧光免疫分析
• 2.1 前言
• 2.2 实验部分
• 2.2.1 试剂和仪器
• 2.2.2 磁性纳米颗粒的制备
• 2.2.3 核壳型磁性颗粒制备
• 2.2.4 hTK1 分别在核壳型磁性颗粒和醋酸纤维素膜[88]上的固定
• 2.2.5 检测过程
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 实验机理
• 2.3.2 hTK1-MNPs 用量的影响
• 2.3.3 缓冲溶液和pH 的选择
• 2.3.4 温育时间的影响
• 2.3.5 酶催化时间的影响
• 2.3.6 抗原检测
• 2.3.7 临床应用
• 2.4 结论
• 第3章 基于纳米金-壳聚糖复合材料的人胸苷激酶? 电化学免疫分析
• 3.1 前言
• 3.2 实验部分
• 3.2.1 试剂与仪器
• 3.2.2 纳米金－壳聚糖复合溶液的制备
• 3.2.3 免疫分析装置的构造
• 3.2.4 免疫分析流程
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 纳米金-壳聚糖复合溶液的量的影响
• 3.3.2 玻碳电极表面的电化学性质
• 3.3.3 玻碳电极表面酶活性测试
• 3.3.4 酶标抗体（HRP-Ab）用量优化
• 3.3.5 抗原（hTK1）测定
• 3.4 结论
• 第4章 利用扫描电化学显微镜测定人胸苷激酶?
• 4.1 引言
• 4.2 实验部分
• 4.2.1 实验仪器
• 4.2.2 材料与试剂
• 4.2.3 金盘基底电极和探头工作电极的处理
• 4.2.4 检测过程
• 4.2.5 伏安法
• 4.2.6 SECM 探头渐进曲线和 SECM 图像
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 铂探头半径的测定
• 2Q 和 BQ 在金电极上的循环伏安响应'>4.3.2 H₂Q 和 BQ 在金电极上的循环伏安响应
• 2Q 与 H₂O₂ 的浓度'>4.3.3 H₂Q 与 H₂O₂的浓度
• 4.3.4 hTK1 的 SECM 图
• 4.4 结论
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录攻读学位期间发表的学术论文