酶抑制—电位法对主要水果蔬菜农药残留现场快速检测方法研究

论文摘要

有机磷和氨基甲酸酯类农药是最常见的两类农药,其杀虫活性高,应用范围广,但对人畜有急性毒性作用,因此它是食品安全检测中的一个重要项目。虽然政府明令禁止将有机磷和氨基甲酸酯类农药中的高毒、剧毒品种用于蔬菜果品的生产,但是根据各地调查,不少地方仍在使用这些国家明确规定在蔬菜上禁用的高毒剧毒农药,因食用含大量农残的蔬菜所引起的人畜中毒事件时有发生,带来了严重的食品安全问题。目前,用于有机磷及氨基甲酸酯类农药的检测方法主要是气相色谱法,此种方法具有较高的准确度和灵敏度,但是需要大型仪器,操作复杂,不适合现场的快速检测。快速检测方法也有多种,各有长处和不足。目前对于农残快速检测的研究,以酶抑制法较多,本文对几种酶抑制法进行了比较研究,确定了植物酯酶电位法的现场检测方法,并且对现场检测的影响因素进行了研究。研究结果如下:（1）对植物酯酶电位法、比色法、固定化酶片法等现场快速检测方法进行了比较:在被检测的六种农药中,电位法对六种农药检测的变异系数在2.34-3.56之间,最低检测限（LOD）在0.008-0.156（mg/Kg）之间同比均优于其他两种检测方法。（2）对电位法进行了优化:以本室制备的植物酯酶为检测用酶,取4mL 50倍稀释的原酶液,加检样或农药2mL,对照管加水,在25℃水浴下抑制15min,然后加入0.5%α-乙酸萘酯（底物）1.4mL,立即测pH值（pH1）,然后放于40℃的水浴中反应30min后,然后放于25℃水浴中10min后,测其pH值（pH2）。以农药浓度的负对数对酶的抑制率作图建立标准工作曲线,以测得样品的对酶抑制率计算农药浓度。（3）对植物酯酶电位法和乙酰胆碱酯酶比色法进行了比较,结果表明:在相同的检测浓度下,对农药对酶抑制程度的检测中,植物酯酶电位法和乙酰胆碱酯酶比色法无明显差异。（4）对水果蔬菜前处理影响因素的研究,并确定了前处理的方法:确定了最佳超声时间为8min,最佳提取溶剂为甲醇:丙酮:乙酸乙酯（1:2:3）。样品匀浆后加入提取溶剂20mL于超声中提取8min。（5）研究了三种提取溶剂对农药的添加回收率,结果表明:电位法对各种农药的检测回收率较高在89%-98%之间,说明电位法的准确度较好,符合农药残留分析的要求。（6）研究了现场检测的影响因素:确定真空冷冻浓缩为保存水果蔬菜对照样的最佳处理方法。并确定了抑制率和农药毒性的关系。抑制率大于70%的为高毒,抑制率50%-70%的为中毒,抑制率30%-50%的为中低毒,抑制率10%-30%的为低毒,抑制率低于10%的为无毒。（7）现场检测流程:以检测西红柿为例:先将部分西红柿匀浆,取西红柿匀浆液5g于100mL的烧杯中,同时于另一个烧杯中按比例加入没有加标的西红柿处理样0.463g,分别加入20mL提取溶剂甲醇:酸乙酯:酮（1:2:3）。然后,两个烧杯置于超声提取其中,提取器中水面略高于烧杯中溶剂的液面。最后,超声8min后取出。于两个试管中分别加入酶液8mL,第一个试管加入对照样的提取液0.5mL,第二个试管加入样品提取液0.5mL,两个试管置于25℃水浴下抑制15min,再分别加入0.5%α-乙酸萘酯（底物）1.4mL,立即测pH值（pH1）,然后放于40℃的水浴中反应30min后,再放于25℃水浴中10min后,测其pH值（pH2）。按照抑制率的公式计算抑制率,然后按照（6）的结果对比农药残留的毒性。

论文目录

• 摘要
• 英文摘要
• 第一章 文献综述
• 1 农药残留快速检测技术研究的意义
• 1.1 我国农药的使用情况
• 1.2 我国目前农药污染情况
• 1.3 农药污染的危害
• 2 农药残留的检测技术
• 2.1 农残分析的前处理方法
• 2.1.1 固相萃取技术（SPE）
• 2.1.2 固相微萃取技术（SPME）
• 2.1.3 基质固相分散萃取技术（MSPDE）
• 2.1.4 超临界流体萃取（SFE）技术
• 2.1.5 微波辅助萃取（MAE）
• 2.2 农药残留分析检测的经典方法
• 2.2.1 气相色谱法
• 2.2.2 高效液相色谱
• 2.2.3 其他色谱检测技术
• 2.3 农药残留快速检测技术
• 2.3.1 酶抑制技术
• 2.3.2 酶液比色法
• 2.3.3 固定化酶片
• 2.3.4 酶传感器法
• 2.3.4.1 传感器
• 2.3.4.2 电位法（ΔpH值法）
• 2.3.4.3 酶联免疫吸附测定技术
• 2.3.4.4 ELISA的原理和方法
• 2.3.4.5 半抗原与结合抗原
• 2.3.4.6 抗体的制备
• 2.3.4.7 影响ELISA的因素
• 第二章 正文
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.2 仪器设备
• 2.3 试验研究方法介绍
• 2.3.1 植物酯酶比色法对农药灵敏度的检测方法
• 2.3.1.1 试剂配制
• 2.3.1.2 试验方法
• 2.3.2 植物酯酶固定化酶片法对农药灵敏度的检测方法
• 2.3.2.1 植物酯酶固定化酶片的制作
• 2.3.2.2 试验方法
• 2.3.3 植物酯酶电位法对农药灵敏度的检测方法
• 2.3.3.1 试剂配制
• 2.3.3.2 实验方法
• 2.3.4 乙酰胆碱酯酶比色法对农药灵敏度的检测方法
• 2.3.4.1 试剂配制
• 2.3.4.2 试验方法
• 2.3.5 植物酯酶法检测农药残留的三种方法比较
• 2.3.5.1 抑制率的比较
• 2.3.5.2 变异系数比较
• 2.3.5.3 最低检测限（LOD）的比较
• 2.3.6 植物酯酶电位法的优化
• 2.3.7 优化后的电位法各种农药标准工作曲线的建立
• 2.4 优化后的植物酯酶电位法和乙酰胆碱酯酶比色法的比较研究
• 2.5 农药前处理影响因素的研究
• 2.5.1 各种水果蔬菜在40℃下反应前后pH值的变化
• 2.5.2 0.1mol/L的盐酸和0.1mol/L氢氧化钠对酶活力的影响
• 2.5.3 各种水果蔬菜匀浆液对酶活力的影响
• 2.5.4 添加提取溶剂剂量的选择
• 2.5.5 超声提取时间的确定
• 2.5.6 各种水果蔬菜匀浆液加提取溶剂后的样品提取液对酶活力的影响
• 2.5.7 各种提取溶剂对不同水果蔬菜的提取添加回收率的研究
• 2.6 植物酯酶电位法检测农药残留抑制率与检测毒性的对比确定
• 2.7 现场检测
• 3 结果与分析
• 3.1 植物酯酶三种农药残留检测方法的比较研究结果
• 3.2 酶液用量和底物用量的关系确定
• 3.3 优化后各种农药标准工作曲线的建立
• 3.4 优化后的植物酯酶电位法和乙酰胆碱酯酶比色法的比较研究
• 3.5 农药前处理影响因素的研究
• 3.5.1 各种水果蔬菜匀浆液在40℃下反应前后pH值的变化
• 3.5.2 0.1mol/L的盐酸和0.1mol/L氢氧化钠对酶活力的影响
• 3.5.3 各种水果蔬菜匀浆液对酶活力的影响
• 3.5.4 检测实验中添加提取溶剂剂量对酶活力的影响
• 3.5.5 超声提取时间的确定
• 3.5.6 各种水果蔬菜匀浆液加提取溶剂后的样品提取液对酶活力的影响
• 3.5.7 三种提取溶剂对不同水果蔬菜的添加回收率的研究
• 3.6 各种农药不同浓度对酶活的抑制情况与农药残留毒性对比
• 3.7 现场检测影响因素的研究
• 4 讨论
• 4.1 现场快速检测方法的比较
• 4.2 酶源的选择
• 4.3 前处理的影响因素
• 4.4 现场检测
• 第三章 结论
• 1. 对植物酯酶电位法、比色法、固定化酶片方法进行了比较
• 2. 对电位法进行了优化
• 3. 对植物酯酶电位法和乙酰胆碱酯酶比色法进行了比较
• 4. 对水果蔬菜前处理影响因素的研究，并确定了前处理的方法
• 5. 研究了三种提取溶剂对农药的回收率
• 6. 对现场检测过程中影响影响因素的研究
• 7. 现场检测流程
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间研究成果