新型固定化脂肪酶的制备及其转酯化活性研究

论文摘要

脂肪酶是一种生物催化剂,具有高选择性、催化反应条件温和、无污染等特点。固定化脂肪酶克服了天然酶稳定性差、易失活、不能重复使用、反应后混入产品、纯化困难等缺点,是酶工程研究的重点。本论文系统研究了以纯棉毛巾为支持物、聚乙烯亚胺(PEI)吸附、戊二醛(GA)或三羟甲基磷(THP)为交联剂固定化脂肪酶的新方法,并系统评价了固定化脂肪酶转酯化比活力。主要研究结果如下:1.系统研究了以GA为交联剂的猪胰脂肪酶固定化过程中,各种溶液的浓度、pH值、温度等因素对酶固定化效果的影响。通过单因子实验得到了优化制备条件为:PEI溶液浓度为3.0mg/m(lpH值7.0);GA溶液浓度为0.2%(pH值8.0);交联温度为40°C;交联时间为60min。在此条件下制备的固定化猪胰脂肪酶催化硬脂酸乙烯酯与戊醇的转酯化比活力为3.82±0.05U/g固定化酶,蛋白载量为50.45±0.12mg/g毛巾,蛋白固定化率为40.36%。2.针对PEI浓度、GA浓度和交联时间进行三因素三水平响应面设计,得到固定化酶制备优化的条件为:PEI浓度3.37mg/ml、GA浓度0.26%(v/v)、交联时间50min,在此条件下固定化脂肪酶催化硬脂酸乙烯酯与戊醇的转酯化比活力预测值可达到5.03U/g固定化酶,验证值为4.99U/g固定化酶。3.优化了三种脂肪酶固定化的洗涤缓冲液pH,其中对猪胰脂肪酶固定化的洗涤缓冲液最适pH为4.5,此时固定化酶催化硬脂酸乙烯酯和戊醇的转酯化比活力为5.02U/g固定化酶;对酯化用脂肪酶的最适pH为5.0,此时固定化酶催化硬脂酸乙烯酯和戊醇的转酯化比活力为12.45U/g固定化酶;对碱性脂肪酶的最适pH为9.0,此时固定化酶催化硬脂酸乙烯酯和戊醇的转酯化比活力为9.81U/g固定化酶。4.系统研究了新型交联剂三羟甲基磷(THP)用于代替GA进行酯化用脂肪酶固定化的新方法。通过单因子优化获得了固定化条件为:0.2g浴巾使用0.5ml PEI(浓度3.37mg/ml,pH7.0)为吸附剂、2ml THP(浓度为0.10%,v/v)为交联剂,交联温度为40℃、交联时间为20min。制备的固定化脂肪酶催化正丁酸乙烯酯与戊醇的转酯化反应,1h底物转化率达92.1%,转酯化比活力达到15.80U/g固定化酶。与GA交联法制备的固定化酶相比,具有良好的重复使用稳定性、温度稳定性和比活力。这是一种低成本、实用性强的脂肪酶固定化新方法。5.研究了THP与GA混合使用的比例对固定化酯化用脂肪酶的影响。当THP与GA比为1:1时固定化脂肪酶转酯化比活力最高为28.17U/g固定化酶。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 引言
• 1.2 脂肪酶的来源及其特点
• 1.3 脂肪酶的催化机理
• 1.4 脂肪酶的固定化
• 1.4.1 脂肪酶的固定化及其意义
• 1.4.2 脂肪酶的固定化载体
• 1.4.3 脂肪酶的固定化方法
• 1.5 固定化脂肪酶催化合成脂肪酸酯
• 1.5.1 酯化反应
• 1.5.2 内酯合成反应
• 1.5.3 转酯化反应
• 1.5.4 酯交换反应
• 1.6 本课题立题背景、研究意义和研究内容
• 1.6.1 本课题立题背景、研究意义
• 1.6.2 研究内容
• 第二章 以戊二醛为交联剂制备固定化脂肪酶
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验仪器
• 2.1.2 实验试剂
• 2.2 脂肪酶溶液的配制
• 2.3 试验方法
• 2.3.1 以GA为交联剂的脂肪酶固定化方法
• 2.3.2 单因素固定化条件的优化
• 2.3.3 单因素优化条件下制备的固定化脂肪酶酶活力评价
• 2.4 分析方法
• 2.4.1 BSA标准曲线的绘制
• 2.4.2 Bradford方法测脂肪酶溶液中蛋白含量
• 2.4.3 固定化脂肪酶蛋白载量的测定
• 2.4.4 固定化率的测定
• 2.4.5 固定化脂肪酶转酯化比活力的测定
• 2.5 结果与讨论
• 2.5.1 PEI浓度和pH对固定化脂肪酶转酯化比活力的影响
• 2.5.2 GA溶液浓度和pH对固定化脂肪酶转酯化比活力的影响
• 2.5.3 交联温度优化
• 2.5.4 交联时间优化
• 2.5.5 单因素优化条件下制备的固定化脂肪酶酶比活力评价
• 2.6 本章小结
• 第三章 脂肪酶的固定化影响因素的系统优化
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 实验仪器
• 3.1.2 实验试剂
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 脂肪酶固定化影响因素的响应面优化
• 3.2.2 洗涤缓冲液pH对三种固定化脂肪酶转酯化比活力的影响
• 3.2.3 最佳条件下固定化脂肪酶与游离酶转酯化比活力的研究
• 3.3 分析方法
• 3.3.1 脂肪酶转酯化比活力的测定
• 3.4 结果与讨论
• 3.4.1 脂肪酶固定化影响因素的响应面优化
• 3.4.2 洗涤缓冲液pH对固定化脂肪酶转酯化比活力的影响
• 3.4.3 最佳条件下固定化脂肪酶与游离酶比活力的比较
• 3.5 本章小结
• 第四章 以三羟甲基磷为交联剂的脂肪酶固定化条件优化
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 实验仪器
• 4.1.2 实验试剂
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 GA为交联剂固定酯化用脂肪酶
• 4.2.2 三羟甲基磷（THP）的制备
• 4.2.3 THP为交联剂制备固定脂肪酶
• 4.2.4 PEI加入量优化
• 4.2.5 交联剂THP浓度优化
• 4.2.6 交联温度
• 4.2.7 交联时间
• 4.2.8 固定化脂肪酶重复使用稳定性比较
• 4.2.9 固定化脂肪酶温度稳定性比较
• 4.2.10 交联剂THP与GA的比例
• 4.3 分析方法
• 4.4 结果与讨论
• 4.4.1 固定化条件对固定化脂肪酶的转酯化比活力的影响
• 4.4.2 固定化脂肪酶的重复使用稳定性比较
• 4.4.3 固定化脂肪酶温度稳定性比较
• 4.4.4 交联剂THP与GA的比例
• 4.5 本章小结
• 结论与展望
• 结论
• 创新点
• 展望
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表论文和申请专利情况
• 致谢
• 附件