人视网膜色素上皮细胞视黄酸信号通路的研究

论文摘要

研究目的在众多近视眼发病机制学说中,“视网膜局部调控学说”备受大家关注,该学说认为视网膜感知外界环境变化后产生一级近视信号因子（如视黄酸,RA）并作用于视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium, RPE）,使之产生二级信号因子（如TGF-β2）,进而调控巩膜的生长,形成近视。本实验研究全反视黄酸B受体阻断剂LE540对培养的人视网膜色素上皮细胞（RPE）分泌碱性成纤维细胞生长因子bFGF及转化生长因子-β2（TGF-β2）的影响。并探讨视黄酸信号通路是否通过调控转录因子激活蛋白-1（activator protein-1, AP-1）来调控转化生长因子β2的分泌。研究方法第一部分：培养人的视网膜色素上皮细胞D407,分别加入含5×10-6M,10×10-6M,40×10-6M三种浓度的全反式视磺酸（all trans retinoic acid, ATRA）培养液,应用MTT法测定D407人RPE细胞增殖,用来寻找进一步实验合适的ATRA浓度。细胞分为6组,细胞近长满时换无血清培养液培养24h。第一组加入10×10-6mol/L的ATRA,第二组加入5×10-6mol/L的LE540,第三组加入等量溶剂DMSO作为对照,然后分别于2h、4h、6h、8h、16h后收集细胞培养液用ELISA方法检测TGF-β2的分泌量。第四组加入10×10-6mol/L的ATRA,第五组加入5×10-6mol/L的LE540,第六组加入等量DMSO作为对照,然后后分别于2h、4h、6h、8h、16h后收集细胞培养液用ELISA方法检测bFGF的分泌量。第二部分：培养人的视网膜色素上皮细胞D407,细胞分为3组,第一组加入加入10×10-6M ATRA,于4h、8h、16h后测AP-1TGFB2表达和分泌；第二组加入10x10-6MATRA和2.5×10-6M受体阻断剂LE540,于4h、8h、16h后测AP-1TGFβ2表达和分泌；第三组加入2.5×10-6M AP-1受体阻断剂,于4h、8h、16h后测TGFβ2表达和分泌。各组收集细胞培养液用ELISA方法检测TGF-B2的分泌量,收集细胞裂解液用Wstern boltting方法检测细胞内AP-1中c-fos的蛋白含量的变化。计量资料数据以x±s表示,采用SPSS11.5统计学软件进行统计学处理,并进行正态分布及Levene方差齐性检验后行t检验或方差分析。研究结果第一部分：MTT检测：40×10-6M的ATRA作用RPE细胞24h后,细胞生长明显受到抑制。5×10-6M和10×10-6M的ATRA对RPE细胞的生长的作用与对照组相比差异无显著性（P>0.05）。TGF-β2和bFGF的检测：10×10-6mol/L的ATRA处理,2h、4h、6h、8h、16h检测发现：实验组TGF-β2的分泌量与对照组比较明显增加,而bFGF的分泌量明显减少（P<0.05）。差别有统计学意义。5×10-6 mol/L的视黄酸受体阻滞剂孵育细胞,2h、4h、6h、8h、16h检测发现：实验组较对照组RPE分泌TGF-β2均明显减少（P<0.05）差别有统计学意义。同时bFGF的分泌量没有明显变化（P=0.178）,差别没有统计学意义。。第二部分：ATRA+LE540组与ATRA组、ATRA+姜黄素组与ATRA组在TGF-β2的分泌量比较,ATRA+LE540组、ATRA+姜黄素组比ATRA组分泌明显减少。P=0.000<0.05,有统计学意义。ATRA+LE540组与ATRA+姜黄素组TGF-β2的分泌量比较,P=0.065>0.05,无统计学差异。蛋白印迹结果显示：ATRA组和ATRA+LE540组4、8、16各个时间点上的c-fos/β-actin灰度比值差异有统计学意义,RA+LE540组c-fos蛋白的表达量明显增加（t=-51.16,P<0.001；t=-40.226,P<0.001;t=-31.706,P<0.001）。研究结论视黄酸信号通路在近视的发病机制中起到重要的作用,我们推测在近视的发生过程中首先是视黄酸分泌量的增加,然后进一步作用于视网膜色素上皮细胞的视黄酸受体B,然后引起转录因子AP-1中的c-fos蛋白表达量的下降,经过细胞内的级联反应最终引起转化生长因子β2的表达增加,对近视的发生起到促进作用。而在这个过程中视黄酸引起碱性成纤维细胞生长因子表达量的下降,但是并不是通过视黄酸B受体而起作用的,具体的作用机制还有待进一步研究。视黄酸促进RPE细胞分泌的TGFβ2的作用可以被视黄酸受体B受体阻断剂LE540以及AP-1受体阻断剂姜黄素部分抑制。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 缩略语/符号说明
• 前言
• 研究现状、成果
• 研究目的、方法
• 一、人视网膜色素上皮细胞分泌TGF-β2和bFGF信号通路的研究
• 1.1 材料和方法
• 1.1.1 细胞
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 主要设备、仪器和耗材
• 1.1.4 方法
• 1.1.5 统计学处理
• 1.2 结果
• 1.2.1 ATRA对人RPE细胞增殖的影响
• 1.2.2 ATRA和LE540对RPE细胞分泌TGF-β2的影响
• 1.2.3 ATRA和LE540对RPE细胞分泌bFGF的影响
• 1.3 讨论
• 1.3.1 ATRA对人RPE细胞增殖的影响
• 1.3.2 ATRA对人RPE细胞分泌bFGF及TGF-β2的影响
• 1.4 小结
• 二、AP-1在人视网膜色素上皮细胞视黄酸信号通路中作用的研究
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 主要实验试剂耗材及仪器
• 2.1.2 实验分组
• 2.1.3 实验方法
• 2.1.4 统计学处理
• 2.2 结果
• 2.2.1 各组对RPE细胞分泌的TGF-β2影响
• 2.2.2 c-fos的Western印迹杂交电泳凝胶成像
• 2.3 讨论
• 2.3.1 AP-1对人RPE细胞分泌TGF-β2的影响
• 2.3.2 LE540对视磺酸信号通路的影响
• 2.3.3 姜黄素在细胞信号通路中的研
• 2.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 发表论文和参加科研情况说明
• 综述 视网膜色素上皮细胞在近视眼发病机制中的研究
• 综述参考文献
• 致谢