玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63诱变菌株的筛选及其活性成分的研究

论文摘要

玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63是从马铃薯疮痂病自然衰退土壤中分离出的一株对多种植物病原菌有抑制作用的生防链霉菌。本文的主要目的是对本实验室前期诱变的734株菌株进行筛选，选取其中活性菌株，利用HPLC和TLC对其固体培养基中的主要成分进行分析。首先以棉花黄萎病菌为指示菌，对734株诱变菌株进行活性筛选，从20％甘油-20℃保存的诱变菌株176株中，筛选到10株有相对较好的抑菌活性的菌株，从斜面4℃保存的558株诱变菌株中筛选到6株相对较好的菌株，通过对这16株菌株进行传代，并结合HPLC对其活性成分进行检测，其中U90″菌株活性成分与出发菌株有差异，且抑菌效果相对较好，确定菌株U90″为进一步研究的对象。用十种不同溶剂对其固体培养基中活性成分进行提取，结果发现，去离子水提取液无抑菌作用，丙酮和乙酸乙酯提取液有较强的抑菌作用，乙酸乙酯提取液抑菌效果最好，为脂溶性，其它几种浸提剂提取液略有活性，同时发现，提取液水洗，水相无抑菌活性；活性成分存在部位的测定试验结果表明，活性成分既存在于菌丝体中又存在于培养基中；在此基础上，进行了丙酮和乙酸乙酯混合提取剂筛选试验，确定了活性成分分离的最佳提取剂为乙酸乙酯与丙酮3：1（v／v）的混合提取剂。对诱变活性菌株U90″抑菌活性成分进行纸层析试验，根据纸层析归类图谱可以看出，此种活性成分属于第六类放线菌素类抗生素。利用HPLC对所筛选到的诱变菌株活性成分的粗提品进行检测，发现三组对棉花黄萎病菌有较好抑制作用的活性组分，最大吸收波长分别为275.7nm，360nm和198.1nm，其中对275.7nm处活性物质进行HPLC洗脱，发现三组比较好的分离条件：（1）50％-80％（乙腈：水），1％／min，进样量5μL，原液pH6；（2）50％-60％（乙腈：水），0.25％／min，进样量5μL，原液pH 6：（3）20％-50％-60％（乙腈：水），2％／min，进样量3μL，pH7。对360nm和275.7nm处组分主峰制备回检发现，前后色谱峰保持一致，推测两组物质均为互变异构体。薄层分析表明甲醇：氯仿为1：6是粗提抗生素薄层层析的最佳展开条件，可分离出9个组分，其中5个组分对棉花黄萎病菌具有抑菌活性，回收产物TLC和HPLC分析表明薄层分离制备的抗生素组分Ⅲ纯度较高，组分Ⅲ紫外光谱最大吸收波长为194.6nm和258.0nm。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 供试菌株
• 2.1.2 供试培养基
• 2.1.3 供试试剂和主要仪器
• 2.2 菌株的培养
• 2.2.1 诱变菌株的培养
• 2.2.2 指示菌株的培养
• 2.3 链霉菌Men-myco-93-63诱变活性菌株的确定
• 2.3.1 诱变菌株的筛选
• 2.3.2 筛选菌株的活性稳定性观察
• 2.3.3 诱变活性菌株的确定
• 2.4 固体培养基中抗生素的提取
• 2.4.1 诱变活性菌株抗生素的生物活性测定
• 2.4.2 诱变活性菌株产生的抗生素的提取
• 2.4.3 单溶剂提取剂的筛选
• 2.4.4 乙酸乙酯和丙酮混合提取剂对诱变活性菌株抗生素的提取
• 2.4.5 诱变活性菌株抗生素活性成分存在部位的测定
• 2.5 纸层析试验
• 2.6 抗生素的高效液相色谱（HPLC）分析
• 2.6.1 抗生素粗品的检测
• 2.6.2 活性成分的跟踪和确定
• 2.6.3 变化分析柱色谱条件分离纯化活性成分
• 2.6.4 抗生素的HPLC制备与回检
• 2.6.5 粗提抗生素的衍生
• 2.7 诱变菌株固体培养基中抗生素的TLC分析
• 2.7.1 TLC分析条件的确定
• 2.7.2 层析产物的回收及抗生素组分的薄层制备
• 2.7.3 抗生素组分的HPLC分析
• 3 结果与分析
• 3.1 链霉菌Men-myco-93-63诱变菌株的筛选
• 3.1.1 诱变活性菌株的初选
• 3.1.2 初筛菌株抗生素粗品的HPLC检测
• 3.1.3 诱变菌株的确定
• 3.2 抗生素提取剂的筛选
• 3.2.1 单溶剂粗提液对棉花黄萎菌的抑制作用
• 3.2.2 乙酸乙酯与丙酮混合提取剂的筛选
• 3.2.3 活性成分存在部位的试验结果
• 3.3 纸层析试验
• 3.4 诱变菌株抗生素色谱峰的制备及检测
• 3.4.1 抗生素色谱峰的检测
• 3.4.2 抗生素色谱峰的粗制备
• 3.4.3 改变HPLC洗脱条件，分离活性成分
• 3.4.4 目标活性峰的HPLC回检
• 3.4.5 360nm吸收波长对应抗生素的衍生
• 3.5 诱变菌株粗品抗生素的TLC分析
• 3.5.1 粗提抗生素TLC分析条件的确定
• 3.5.2 粗提抗生素组分分离制备及活性组分的检测
• 3.5.3 粗提抗生素分离组分的TLC检测和HPLC分析
• 4 讨论
• 4.1 关于颉颃链霉菌诱变菌株的筛选
• 4.2 固体培养基中抗生素的提取
• 4.3 高效液相色谱对抗生素活性成分的检测
• 4.4 关于互变异构体的衍生
• 4.5 试验过程中存在的问题及下一步的研究工作
• 5 结论
• 参考文献
• 附录
• 在读期间发表的学术论文
• 作者简历
• 致谢