红串红球菌手性醇脱氢酶的克隆表达、酶学性质及催化应用研究

论文摘要

2,3-丁二醇是重要的平台化合物,具有广泛的工业应用,而光学纯的2,3-丁二醇可用于多种医药中间体的合成。本论文以实验室自有的红串红球菌（Rhodococcus erythropolis WZO10）为出发菌株,发现该菌具有.发酵生成手性2,3-丁二醇的能力,其基因组含有两个编码2,3-丁二醇脱氢酶的基因。论文对这两个2,3-丁二醇脱氢酶基因进行体外重组表达,进而详细研究了其酶学性质及催化特性,结果如下：1.R. erythropolis WZO10发酵葡萄糖生成微量的（2S,3S）-2,3-丁二醇（<0.5mM）,若在发酵过程中添加前体物质2,3-丁二酮,发酵产物中又有（2R,3R）-2,3-丁二醇生成。将2,3-丁二醇脱氢酶基因rebdh-s和rebdh-m分别连接至pEASY-E1载体上并在E.coli BL21（DE3）中实现重组表达。经分离纯化后,重组ReBDH-S和ReBDH-M的还原反应比活力分别为9.16和11.3U/mg。对这两个基因进行一、二、三级结构分析后发现,ReBDH-S属于短链脱氢酶/还原酶家族,其四级结构为同源二聚体,而ReBDH-M属于中链脱氢酶/还原酶家族,每亚基含有两分子的Zn2+,为单体蛋白质。2.对ReBDH-S与ReBDH-M的酶学性质进行了详细研究。在氧化反应中,ReBDH-S最适温度及pH分别是25℃和pH 9.5；在还原反应中,其最适值为30℃和pH 7.0。氧化和还原反应的最适底物分别是2-戊醇和2,3-丁二酮。ReBDH-S具有优异的立体选择性,能催化还原2,3-丁二酮生成光学纯的（2S,3S）-2,3-丁二醇。该酶能耐受较高浓度的有机溶剂及金属离子,在30%的DMSO中放置4h后仍保有初始活力的50%以上。对于ReBDH-M,在氧化反应中其最适温度及pH分别是45℃和pH 10.0；在还原反应中,其最适值为55℃和pH 6.5。氧化和还原反应的最适底物分别是2,3-丁二醇及乙偶姻。该酶对有机溶剂及金属离子耐受性稍差。与ReBDH-S类似,ReBDH-M也具有优异的立体选择性,能催化还原2,3-丁二酮生成光学纯的（2R,3R）-2,3-丁二醇。酶学参数表明,与NAD+和2,3-丁二醇相比,ReBDH-S和ReBDH-M均对NADH和2,3-丁二酮有更低的Km和更高的催化效率,因而它们在胞内丁二醇合成中可能扮演重要角色。3.建立了两种新型的手性醇不对称合成的模式反应,这两种反应体系中辅酶均高效循环。反应1以ReBDH-S为催化剂,将2,3-丁二酮的不对称还原与混旋1-苯乙醇的立体选择性氧化偶联,可同时获得（2S,3S）-2,3-丁二醇和职)-1-苯乙醇,其中两种底物的转化率分别达到了100%与49.3%,两种手性醇的e.e.值也分别是99.9%与97%,体系TTN值达到210,实现辅酶高效再生。反应2利用ReBDH-S与ReBDH-M立体选择性的互补特征,以混旋次级醇为底物,一锅法双酶催化去消旋化合成单一构型的手性醇。以消旋的2-戊醇为底物时,去消旋化结果表明,其中($-2-戊醇有大约30%转化生成了（R）-2-戊醇,最终（R）-2-戊醇得率约有76.3%,TTN值也有23。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 2,3-丁二醇的性质
• 1.2 2,3-丁二醇的生产方法
• 1.2.1 化学法生产2,3-丁二醇
• 1.2.2 微生物法生产2,3-丁二醇
• 1.3 醇脱氢酶的分类及特征
• 2+醇脱氢酶的结构及功能特点'>1.3.1 含Fe²⁺醇脱氢酶的结构及功能特点
• 2+醇脱氢酶的结构及功能特点'>1.3.2 含Zn²⁺醇脱氢酶的结构及功能特点
• 1.3.3 不含金属离子醇脱氢酶的结构及功能特点
• 1.4 2,3-丁二醇脱氢酶
• 1.4.1 （2S,3S）-2,3-丁二醇脱氢酶
• 1.4.2 （2R,3R）-2,3-丁二醇脱氢酶
• 1.4.3 meso-2,3-丁二醇脱氢酶
• 1.5 辅酶循环体系的构建
• 1.5.1 双底物偶联法辅酶再生
• 1.5.2 双酶偶联法辅酶再生
• 1.6 本论文的研究背景、内容及意义
• 参考文献
• 第二章 醇脱氢酶ReBDH-S与ReBDH-M的基因克隆与表达
• 2.1 引言
• 2.2 实验材料
• 2.2.1 菌种及质粒载体
• 2.2.2 试剂与材料
• 2.2.3 培养基
• 2.2.4 缓冲液及洗脱液
• 2.2.5 主要仪器
• 2.3 试验方法
• 2.3.1 红串红球菌发酵及终端产物检测
• 2.3.2 目的基因的克隆
• 2.3.3 重组质粒pEASY-E1-bdh的表达
• 2.3.4 重组蛋白的纯化
• 2.3.5 重组蛋白天然分子量的检测
• 2.3.6 重组蛋白ReBDH-S与ReBDH-M结构分析
• 2.4 结果与分析
• 2.4.1 R.erythropolis WZ010发酵终端产物的检测
• 2.4.2 ReBDH-S与ReBDH-M的基因克隆及分子特征
• 2.4.3 ReBDH-S与ReBDH-M的表达及纯化
• 2.4.4 重组ReBDH-S与ReBDH-M天然分子量的测定
• 2.4.5 重组蛋白一、二、三级结构分析
• 2.5 本章讨论与小结
• 参考文献
• 第三章 醇脱氢酶ReBDH-S与ReBDH-M的酶学性质表征
• 3.1 引言
• 3.2 实验材料
• 3.2.1 菌种
• 3.2.2 试剂与材料
• 3.2.3 培养基
• 3.2.4 缓冲液及洗脱液
• 3.2.5 主要仪器
• 3.3 试验方法
• 3.3.1 重组酶活力的测定
• 3.3.2 重组酶的酶学性质
• 3.3.3 重组酶立体选择性的确立
• 3.4 结果与分析
• 3.4.1 重组ReBDH-S与REBDH-M的底物特异性
• 3.4.2 温度及pH值对重组酶的影响
• 3.4.3 金属离子及有机助溶剂对酶活力的影响
• 3.4.4 重组酶ReBDH-S与ReBDH-M的动力学参数
• 3.4.5 重组酶ReBDH-S与ReBDH-M立体选择性的确立
• 3.5 本章讨论与小结
• 参考文献
• 第四章 重组酶在生物催化方面的应用探索
• 4.1 引言
• 4.2 实验材料
• 4.2.1 菌种及质粒载体
• 4.2.2 培养基
• 4.2.3 缓冲液
• 4.2.4 试剂与材料
• 4.2.5 主要仪器
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 甲酸脱氢酶FDHCB和FDHP101的制备
• 4.3.2 酶法合成手性醇
• 4.3.3 酶法不对称合成手性醇的结果检测
• 4.4 结果与分析
• 4.4.1 FDH的制备
• 4.4.2 手性醇的不对称合成
• 4.5 本章讨论与小结
• 参考文献
• 第五章 总结与展望
• 5.1 结论
• 5.2 展望
• 攻读硕士学位期间论文发表情况
• 致谢