酵母细胞HD-5催化（2S，5S）-2，5-己二醇的不对称合成研究

论文摘要

(2S,5S)-2,5-己二醇是重要的手性药物中间体和手性膦化合物配体。目前普遍采用化学拆分法制备单构型（2S,5S）-2,5-己二醇。国内（2S,5S）-2,5-己二醇生产尚属空白。本工作筛选酵母HD-5催化不还原2,5-己二酮,合成（2S,5S）-2,5-己二醇。建立了生物转化培养液中底物2,5-己二酮和产物2,5-己二醇的气相色谱检测方法。以乙二醇为内标物,2,5-己二酮和2,5-己二醇均在0.5～40 mmol?L-1范围内,线性关系良好。建立柱前衍生化-毛细管气相色谱法测定2,5-己二醇对映体含量的方法。用S-（-）-α-苯乙基异氰酸酯与外消旋2,5-己二醇反应,生成相应的衍生物在气相色谱上得到基线分离,同时考察载气流速和程序升温对拆分的影响,检验该方法的重现性和准确度,确定最佳的拆分条件为:进样器温度270℃,检测器温度290℃,分流比4.9∶1,流速6.2 mL·L-1。从9株酵母菌株中,筛选出对2,5-己二酮具有较高催化还原活性的菌株HD-5。采用气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）分析推断,酵母HD-5还原2,5-己二酮分两步进行,先生成中间产物（S）-5-羟基-2-己酮,然后生成（2S,5S）-2,5-己二醇。考察了底物2,5-己二酮和产物2,5-己二醇浓度对酵母HD-5生长特性的影响。在底物浓度低于40 mmol·L-1、产物浓度低于50 mmol·L-1时,酵母HD-5的生长不受影响。考察了表面活性剂吐温-80、CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）和THF（四氢呋喃）对还原反应的影响。在培养液中添加3.0 g·L-1的吐温-80,有助于提高产物的得率,而不影响目标产物的光学纯度。系统地研究了培养基组成、温度、pH值、接种量、初始葡萄糖浓度、初始底物浓度和产物浓度对酵母HD-5细胞催化2,5-己二酮还原活性和光学选择性的影响。优化的反应条件是有机培养基、温度32oC、pH 6.0、接种量50 g·L-1（细胞干重）和初始葡萄糖浓度20 g·L-1。随着初始底物浓度增加,中间产物的平均累积速率逐渐增加,中间产物的累积浓度超过30 mmol·L-1时,目标产物的生成速率降低。当产物浓度高于70 mmol·L-1时,目标产物的生成速率明显下降。在优化的反应条件下,底物浓度维持在5.0 mmol·L-1左右（前12h）,底物累计加入56.5 mmol·L-1。还原反应历时72h,目的产物浓度达到53.8 mmol·L-1,得率为95.2%,选择性为94.38%,目的产物的e.e值为93.76%。本工作关于高效合成（2S,5S）-2,5-己二醇菌株的筛选和生物催化还原条件的优化研究,为进一步放大实验提供依据。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 引言
• 1.1 手性药物的重要性与发展前景
• 1.1.1 手性药物的重要性
• 1.1.2 手性药物的发展前景
• 1.2 手性化合物的制备技术
• 1.2.1 物理法
• 1.2.2 化学法
• 1.2.3 生物法
• 1.2.4 化学－酶合成法
• 1.3 酵母催化不对称合成的类型
• 1.3.1 单羰酮的还原
• 1.3.2 β-酮酯的还原
• 1.3.3 α-羟基醛或酮的还原
• 1.3.4 含硫官能团酮的还原
• 1.3.5 β-二酮的还原
• 1.4 手性2,5-己二醇的用途和制备技术研究进展
• 1.4.1 手性2,5-己二醇的用途
• 1.4.2 手性2,5-己二醇的制备方法
• 1.5 本课题的立论依据
• 1.6 主要研究内容及创新之处
• 第二章 材料与方法
• 2.1 实验仪器与化学试剂
• 2.1.1 实验仪器
• 2.1.2 菌种与化学试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 水相中2,5-己二酮与2,5-己二醇萃取剂的选择
• 2.2.2 转化过程中2,5-己二酮与2,5-己二醇之分布情况
• 2.2.3 不同条件下2,5-己二酮与2,5-己二醇损失情况
• 2.2.4 细胞培养
• 2.2.5 酵母筛选
• 2.2.6 底物和产物对酵母细胞生长的影响
• 2.2.7 底物和产物对酵母细胞抑制作用的考察
• 2.2.8 不同培养基对不对称还原反应的影响
• 2.2.9 不同表面活性剂对细胞生长和代谢的影响
• 2.2.10 不同表面活性剂对不称还原的影响
• 2.2.11 表面活性剂浓度对不对称还原反应的影响
• 2.2.12 纯水相体系生物催化还原反应
• 2.2.13 不同产物浓度对不称还原的影响
• 2.2.14 底物2,5-己二酮的分批补加试验
• 2.3 分析方法
• 2.3.1 有机相中底物和产物的检测方法
• 2.3.2 水相中底物和产物的检测方法
• 2.3.3 柱前衍生化法-毛细管气相色谱测定2,5-己二醇的对映体纯度
• 2.3.4 发酵液中各组分的气相色谱-质谱检测方法
• 第三章 结果与讨论
• 3.1 发酵液中产物和底物浓度的测定
• 3.1.1 内标物的选择
• 3.1.2 有机相法检测底物和产物的标准曲线
• 3.1.3 水相法检测底物和产物的标准曲线
• 3.1.4 两种方法的对比
• 3.1.5 最低检测浓度
• 3.1.6 发酵样品的检测
• 3.2 柱前衍生化-毛细管气相色谱拆分2,5-己二醇对映体
• 3.2.1 2,5-己二醇对映体的气相色谱分析和鉴定
• 3.2.2 载气流速的影响
• 3.2.3 柱温的影响
• 3.2.4 重现性测定
• 3.2.5 准确度测定立
• 3.3 合成（2S,5S）-2,5-己二醇菌株的筛选
• 3.3.1 菌种筛选
• 3.3.2 催化还原2,5-己二酮菌株的二次筛选
• 3.3.3 发酵液中中间产物结构的质谱分析
• 3.4 水相中2,5-己二酮与2,5-己二醇萃取剂的选择
• 3.5 水相反应体系中底物和产物的损失情况
• 3.6 水相反应体系中底物和产物的分配情况
• 3.7 菌株 HD-5 的生长的评价
• 3.7.1 不同浓度底物和产物对菌体生长的影响
• 3.7.2 菌株对底物的耐受性考察
• 3.7.3 菌株对产物的耐受性考察
• 3.8 不同表面活性剂对反应的影响
• 3.8.1 不同浓度底物和产物对菌体生长的影响
• 3.8.2 不同表面活性剂对不对称还原的影响
• 3.8.3 不同吐温加入量对反应的的影响
• 3.9 不同培养基对产物生成的影响
• 3.10 2,5-己二酮不对称还原反应的最适pH
• 3.11 2,5-己二酮不对称还原反应的最适温度
• 3.12 接种量对2,5-己二酮生物转化的影响
• 3.13 初始葡萄糖浓度对2,5-己二酮转化的影响
• 3.14 初始底物浓度对酵母 HD-5 催化还原反应的影响
• 3.15 不同产物浓度对生物转化的影响
• 3.16 底物2,5-己二酮分批补加试验
• 结论
• 一.结论
• 二.建议
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历