比较不同途径移植骨髓间充质干细胞治疗脑缺血再灌注模型大鼠的效果

论文摘要

目的：分别采用颈动脉、尾静脉和立体定向三途径移植骨髓间充质干细胞（BMSCs）治疗大脑中动脉栓塞（MCAO）模型大鼠,比较三途径移植BMSCs对MCAO模型大鼠的疗效及其详细的作用机制。方法：直接贴壁法分离培养、纯化和扩增BMSCs;流式细胞仪鉴定BMSCs表面抗原CD90、CD29、CD106、CD34、CD45、CD11b; 10μmol/L的Brdu标记示踪BMSCs;线栓法制作MCAO模型大鼠；经颈动脉、尾静脉和立体定向途径分别移植3×106 BMSCs治疗MCAO建模后第7天的SD大鼠；建模后第1、7、14、21、28、35天分别采用改良神经功能损伤评分（mNSS）、粘附实验和体重评估大鼠的神经功能和体能恢复情况；建模后第35天处死大鼠,取脑组织做组织学,免疫荧光及免疫组化染色：Bielshowsky’s-Luxol Fast Blue双染检测神经纤维的再生情况；直接免疫荧光法检测Brdu标记的BMSCs;免疫组织化学检测大鼠脑组织NSE、Nogo-A、SYN、Ki-67、GFAP及VEGF表达。结果:BMSCs贴壁生长,形态呈梭形,加入10μmol/L的Brdu孵育48h后BMSCs标记率达95.0±8.40%。BMSCs高表达CD90 （91.70%）、CD29 （88.40%）、CD106 （52.20%）,低表达CD34 （2.70%）、CD45 （5.65%）、CD11b （7.82%）。与PBS对照组比较,颈动脉途径组的大鼠神经功能于建模第14天后显著好转（P<0.05）,尾静脉和立体定向途径组于建模第21天后显著好转（P<0.05）,且建模后第35天颈动脉途径组的大鼠神经功能显著优于其它两途径组（P<0.05）。三途径BMSCs移植组与PBS对照组比较,梗死侧胼胝体的面积均显著增大（P<0.05）,且颈动脉途径组的胼胝体面积大于其它两途径组（P<0.05）。脑组织SYN、Ki-67、GFAP和VEGF的表达增多（P<0.05）, Nogo-A表达降低（P<0.05）, NSE无显著变化（P>0.05）。动脉途径组的SYN、Ki-67阳性细胞数显著高于尾静脉和立体定向途径组（P<0.05）,同时Nogo-A的表达显著低于尾静脉和立体定向途径组（P<0.05）。三途BMSCs移植组的脑梗死体积和胶质瘢痕与PBS对照组比较无统计学差异（P>0.05）。脑组织的下述抗原阳性细胞数的相关性分析：GFAP与VEGF、GFAP与Ki-67呈高度正相关（r=0.725, r=0.742, p<0.05）, Nogo-A与SYN呈高度负相关（r=-0.842,p<0.05）。结论：不同途径移植BMSCs均能促进脑梗死大鼠的神经功能恢复,但动脉途径起效更快且后期疗效优于静脉和立体定向途径。BMSCs治疗脑梗死的作用机制可能包括促进内源性细胞增殖、血管再生和突触重建,增强神经纤维修复和星形胶质细胞保护功能。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语
• 第1章 引言
• 第2章 材料与方法
• 2.1 主要试剂
• 2.2 实验动物
• 2.3 实验设备
• 2.4 实验分组
• 2.5 实验方法
• 2.5.1 全骨髓贴壁法分离和扩增BMSCs
• 2.5.2 BMSCs的流式鉴定
• 2.5.3 Brdu标记BMSCs与直接免疫荧光法检测标记率
• 2.5.4 大脑中动脉栓塞（MCAO）模型大鼠
• 2.5.5 颈动脉途径移植BMSCs治疗MCAO模型大鼠
• 2.5.6 立体定向途径移植BMSCs治疗MCAO模型大鼠
• 2.5.7 尾静脉途径移植BMSCs治疗MCAO模型大鼠
• 2.5.8 检测MCAO模型大鼠的神经功能
• 2.5.9 4%多聚甲醛灌注取脑
• 2.5.10 脑组织HE染色
• 2.5.11 脑组织Bielshowsky's-Luxol Fast Blue staining双染
• 2.5.12 脑组织直接免疫组织荧光染色
• 2.5.13 脑组织免疫组织化学染色（二步法）
• 2.5.14 图片采集与测量
• 2.5.15 统计学分析
• 第3章 结果
• 3.1 BMSCs体外培养的形态与Brdu标记
• 3.2 BMSCs流式鉴定
• 3.3 MCAO模型大鼠的神经功能和体重比较
• 3.3.1 mNSS评分
• 3.3.2 粘附实验
• 3.3.3 体重比较
• 3.4 HE染色测量脑梗死体积
• +-BMSCs'>3.5 IBZ区Brdu⁺-BMSCs
• 3.6 Bielshowsky's-Luxol Fast Blue双染
• 3.7 免疫组织化学染色结果
• +细胞'>3.7.1 IBZ区的SYN⁺细胞
• +细胞'>3.7.2 SVZ区的Ki-67⁺细胞
• +细胞'>3.7.3 IBZ区的Nogo-A⁺细胞
• +和VEGF⁺细胞'>3.7.4 IBZ区的NSE⁺和VEGF⁺细胞
• +细胞和GSR区的胶质瘢痕厚度'>3.7.5 SBZ区的GFAP⁺细胞和GSR区的胶质瘢痕厚度
• 3.7.6 相关性分析
• 第4章 讨论
• 第5章 结论与展望
• 5.1 结论
• 5.2 展望
• 致谢
• 参考文献
• 攻读学位期间的研究成果
• 综述
• 参考文献