拟南芥悬浮细胞生物学及其遗传转化模式

论文摘要

本文从拟南芥悬浮细胞及其愈伤组织生物学特性研究入手，以期制备适合农杆菌高效转化的受体材料，并制定科学、合理、有效的转化方案；利用所构成的多个质粒载体，进行拟南芥悬浮细胞基因转化，以检验多种转化方案的可行性，并优化转化条件；检测转化细胞报告基因的瞬时表达和稳定表达，以期建立有效的转化模式，并获得可利用的转化材料。本论文所做的主要工作如下： 1、拟南芥悬浮细胞及其愈伤组织生长特性与培养条件 试验研究了拟南芥悬浮细胞及其愈伤组织的生长特性及其继代培养条件，旨在摸索维持拟南芥悬浮细胞正常稳定生长的培养技术，并为拟南芥悬浮细胞进一步的遗传操作提供良好的受体材料和科学依据。结果表明，在每个7d一次的继代周期中，拟南芥悬浮细胞的生长表现明显的S型生长曲线。正常培养条件下，继代后2-4 d出现快速生长时期，此后生长量迅速下降，但接种量不同，其继代后悬浮细胞生物量及快速增长发生时期不同。维持7d继代周期的理想接种量为起始悬浮液按10ml／50ml稀释。接种量小，生长迟缓，甚至不能增殖。培养基中不同激素及不同蔗糖含量均会对其生长产生极明显的影响，在B5+0.2mg／L NAA条件下反复继代后的细胞，再加入外源NAA时，反而会抑制其生长。蔗糖含量以30g／L最好；蔗糖含量低，悬浮生物量及细胞活性明显下降。 拟南芥愈伤组织生长也呈现一定的规律性，正常条件下，需经历约各10d的诱导时期、快速生长时期和生长停滞及老化时期。愈伤组织诱导及其生长对外界条件也特别敏感，一定的表面湿度及较低的培养温度是必须的。 2、拟南芥悬浮细胞及其愈伤组织对抗生素的反应 试验研究了拟南芥悬浮及其愈伤组织对潮霉素、卡那霉素、头孢霉素等3种抗生素的反应，为拟南芥悬浮细胞转化子抗生素选择浓度和选择方案的制定提供依据。结果表明：潮霉素对拟南芥悬浮细胞生长、愈伤组织诱导及其生长均有极明显的抑制作用，但作用效果和特性均有所不同。拟南芥悬浮细胞继代培养阶段、愈伤组织诱导阶段和愈伤组织增殖阶段的临界致死浓度分别为25，2.5，1.5mg／L，液体与固体培养条件下差异极大。当采用潮霉素抗性标记筛选转化子时，应当分别采用相应阶段的临界致死浓度作为转化子选择浓度。与此同时，潮霉素需要一定处理时间才能充分表现其抑制细胞生长或杀死细胞的效果，一般液体培养条件下3d以后、固体培养条件下5d以后效果趋于稳定，但不同的处理浓度有较大差异，建议选择时间在液体培养条件下不少于3d，在固体培养条件下不少于5d。否则，假阳性率会很高，从而大大加重后续转化子检测的工作量。 卡那霉素与潮霉素有类似的影响，在愈伤组织诱导阶段，适宜的选择浓度为50mg／L，根据潮霉素作用特性推测，其在液体培养阶段和愈伤组织生长阶段的适宜选择浓度分别在100mg／L、25mg／L左右。后续的转化试验中，若利用卡那霉素选择，我们将采用这一选择浓度。 试验中意外发现头孢霉素能促进绿色悬浮细胞的获得，并具有逆转悬浮细胞

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 缩略词
• 1 综述—植物遗传转化及模式植物拟南芥研究进展
• 1.1 植物遗传转化研究和利用简况
• 1.2 植物遗传转化方法
• 1.2.1 间接转化方法
• 1.2.1.1 农杆菌介导法（Agrobacterium-mediated transformation）
• 1.2.1.2 脂质体法（liposome）
• 1.2.1.3 原生质球法
• 1.2.1.4 病毒载体转化法
• 1.2.2 外源 DNA直接转化法
• 1.2.2.1 基因枪法（particle gun，gene gun，biolistics，microprojectile）
• 1.2.2.2 化学药剂诱导法
• 1.2.2.3 花粉管通道法（pellen-tube pathway）
• 1.3 根癌农杆菌介导的遗传转化原理
• 1.4 农杆菌介导的遗传转化影响因素
• 1.4.1 载体因素
• 1.4.2 寄主因素
• 1.4.3 菌株因素
• 1.4.4 共培养条件
• 1.4.4.1 外植体预处理
• 1.4.4.2 外植体接种
• 1.4.4.3 培养基成分
• 1.4.4.4 共培养方法
• 1.5 转化体标记基因选择策略
• 1.5.1 选择基因
• 1.5.2 报告基因
• 1.5.3 安全标记基因
• 1.6 转化体的分子检测
• 1.7 转基因沉默
• 1.7.1 导致转基因沉默的机理
• 1.7.2 控制基因沉默的策略
• 1.7.2.1 转化方法的选择
• 1.7.2.2 避免重复序列的产生
• 1.7.2.3 实现共整合与共表达的一致
• 1.7.2.4 对外源基因进行修饰
• 1.7.2.5 避免反义RNA的产生
• 1.7.2.6 MAR的应用
• 1.7.2.7 利用具有组织与发育特异性调控作用的增强子
• 1.7.2.8 利用特异性重组系统
• 1.7.3 转录后基因沉默的利用
• 1.8 转基因安全
• 1.8.1 标记基因的安全策略
• 1.8.1.1 标记基因的分离剔除法
• 1.8.1.2 标记基因的重组剔除法
• 1.8.2 环境安全性
• 1.8.3 食品安全性
• 1.9 模式植物拟南芥研究进展及其在植物基因工程中的应用
• 1.9.1 拟南芥的生物学特性
• 1.9.2 拟南芥的核基因组研究
• 1.9.3 拟南芥组织培养
• 1.9.4 拟南芥基因转化及其应用
• 1.9.5 展望
• 1.10 本研究的目的和意义
• 2 拟南芥悬浮细胞及其愈伤组织生长特性与培养条件
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 材料来源
• 2.1.2 培养基配方及其制备
• 2.1.3 悬浮细胞继代培养
• 2.1.4 悬浮细胞愈伤组织诱导及愈伤组织继代培养
• 2.1.5 悬浮细胞生物量快速测定
• 2.1.6 增殖倍数与继代指数测算
• 2.1.7 悬浮细胞活性测定
• 2.1.8 悬浮细胞生长模型的建立
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 拟南芥悬浮细胞生长特性
• 2.2.1.1 不同接种量对悬浮细胞的影响
• 2.2.1.2 悬浮细胞的理论生长模型
• 2.2.1.3 不同接种量悬浮细胞的增殖倍数及继代指数
• 2.2.2 激素对拟南芥悬浮细胞生长的影响
• 2.2.3 蔗糖浓度对拟南芥悬浮细胞生长及活性的影响
• 2.2.4 拟南芥悬浮细胞愈伤组织诱导及其生长特性
• 2.2.5 影响拟南芥愈伤组织诱导及其生长的主要因素
• 2.3 讨论
• 2.3.1 悬浮细胞生物量及活性测定的可靠性
• 2.3.2 拟南芥悬浮细胞及其愈伤组织生长特性
• 2.3.3 拟南芥悬浮细胞生长条件
• 2.4 结论
• 3 拟南芥悬浮细胞及其愈伤组织对抗生素的反应
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 试验材料
• 3.1.2 液体条件下抗生素处理试验
• 3.1.3 固体条件下抗生素处理试验
• 3.1.4 细胞活性TTC法定量测定
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 液体条件下拟南芥悬浮细胞对抗生素的反应
• 3.2.1.1 不同浓度潮霉素对拟南芥悬浮细胞的作用效果
• 3.2.1.2 潮霉素对拟南芥悬浮细胞的作用特性
• 3.2.2 拟南芥悬浮细胞愈伤组织诱导阶段对抗生素的反应
• 3.2.2.1 对潮霉素的反应
• 3.2.2.2 对卡那霉素的反应
• 3.2.3 拟南芥愈伤组织继代增殖阶段对抗生素的反应
• 3.2.4 头孢霉素对拟南芥悬浮细胞“白化”的逆转效果
• 3.3 讨论
• 3.3.1 有关液体与固体培养条件下抗生素作用效果差异的讨论
• 3.3.2 有关野生型拟南芥对抗生素的耐受性和适应性的讨论
• 3.3.3 有关拟南芥悬浮细胞“白化”及头孢霉素逆转机理的讨论
• 3.4 结论
• 4 拟南芥悬浮细胞耐受性试验
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 材料来源
• 4.1.2 悬浮细胞维持培养方法
• 4.1.3 悬浮细胞密度、活性及耐受性测定
• 4.1.4 试验设计
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 不同处理拟南芥悬浮细胞的整体表现
• 4.2.2 不同处理拟南芥悬浮生物量及其相对活性变化动态的比较
• 4.2.2.1 总生物量的变化规律
• 4.2.2.2 活生物量的变化规律
• 4.2.2.3 细胞相对活性的变化规律
• 4.2.3 拟南芥悬浮细胞对不同处理耐受性的比较
• 4.3 讨论
• 4.3.1 拟南芥悬浮细胞对生存条件耐受性机制的讨论
• 4.3.2 活细胞密度与细胞活性恢复
• 4.3.3 环境胁迫与基因转化中预处理
• 4.3.4 静置培养与基因转化中共培养
• 4.4 结论
• 5 拟南芥悬浮细胞超低温保存试验
• 5.1 材料和方法
• 5.1.1 材料来源
• 5.1.2 保存方法
• 5.1.3 悬浮细胞TTC活性测定
• 5.1.4 试验设计
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 拟南芥悬浮细胞超低温保存的基本条件
• 5.2.2 拟南芥悬浮细胞大小对超低温保存的影响
• 5.2.3 预处理对拟南芥悬浮细胞超低温保存的影响
• 5.2.4 拟南芥悬浮细胞超低温保存优化方案
• 5.3 讨论
• 5.3.1 冰冻保护剂
• 5.3.2 冰冻程序
• 5.3.3 解冻程序
• 5.3.4 细胞水分含量
• 5.4 结论
• 6 拟南芥悬浮细胞遗传转化——农杆菌的转化与制备
• 6.1 材料
• 6.1.1 受体菌及转化质粒
• 6.1.2 主要化学试剂及试剂盒
• 6.1.3 培养基配方及溶液（缓冲液）配制
• 6.1.4 主要仪器设备
• 6.2 方法
• 6.2.1 菌株选择及培养方法
• 6.2.2 质粒载体转化细菌方法
• 6.2.3 碱法少量提取质粒DNA（Mini Prep）
• 6.2.4 QIAGEN-tip 100中量提取质粒DNA（Midi Prep）
• 6.2.5 酶切反应
• 6.2.6 PCR反应
• 6.2.7 DNA电泳分析
• 6.2.8 转化子统计与分析
• 6.2.9 细胞密度测定与生长模型建立
• 6.2.10 菌株保存与活化
• 6.3 结果与分析
• 6.3.1 质粒载体构建策略及克隆位点
• 6.3.2 pBIB/GUS和pBIB/SARs转化农杆菌后DNA检测
• 6.3.3 pBINm-gfp5-ER对根癌农杆菌的转化效率分析
• 6.3.4 pBINm-gfp5-ER对转化根癌农杆菌的DNA检测
• 6.3.5 农杆菌菌株生长情况
• 6.3.5.1 pBIB系列菌株生长特性
• 6.3.5.2 LBA-gfp-9、LBA-gfp-10菌株生长特性
• 6.3.5.3 接种量对菌株生长的影响
• 6.4 讨论
• 6.4.1 关于质粒载体
• 6.4.2 关于电转化频率
• 6.4.3 关于质粒DNA提取
• 6.4.4 关于菌株生长密度
• 6.5 结论
• 7 拟南芥悬浮细胞遗传转化—转化模式与转化细胞选择
• 7.1 材料
• 7.1.1 转化材料
• 7.1.2 载体系统
• 7.1.3 主要化学试剂
• 7.1.4 主要仪器设备
• 7.2 方法
• 7.2.1 菌株选择培养方法
• 7.2.2 转化细胞选择培养方法
• 7.2.3 转化细胞报告基因诊断
• 7.2.4 转化模式（方案）与程序
• 7.2.4.1 模式Ⅰ
• 7.2.4.2 模式Ⅱ
• 7.2.4.3 模式Ⅲ
• 7.3 结果与分析
• 7.3.1 转化模式的比较分析
• 7.3.1.1 模式Ⅰ转化结果分析
• 7.3.1.2 模式Ⅱ转化结果分析
• 7.3.1.3 模式Ⅲ转化结果分析
• 7.3.2 转化模式优化
• 7.3.2.1 预处理的效果
• 7.3.2.2 静置共培养对转化效率的影响
• 7.3.2.3 恢复培养与液体选择的效果
• 7.3.3 不同质粒载体的转化效果
• 7.3.4 优化后效果
• 7.4 讨论
• 7.4.1 关于GUS基因的瞬时表达
• 7.4.2 关于抗生素选择与假阳性现象
• 7.4.3 关于群体选择与个体选择
• 7.5 结论
• 8 拟南芥悬浮细胞遗传转化—报告基因诊断与分子检测
• 8.1 材料
• 8.1.1 转化材料及转化载体
• 8.1.2 主要化学试剂
• 8.1.3 主要仪器设备
• 8.2 方法
• 8.2.1 转化细胞（愈伤组织）GUS组织化学染色
• 8.2.2 拟南芥基因组 DNA抽提
• 8.2.3 DNA电泳分析
• 8.2.4 PCR检测
• 8.2.5 蛋白质抽提
• 8.2.6 蛋白质分离—SDS-PAGE
• 8.2.7 Western杂交
• 8.3 结果与分析
• 8.3.1 二次选择抗性愈伤组织GUS诊断结果
• 8.3.2 拟南芥愈伤组织DNA抽提
• 8.3.3 GUS阳性愈组织PCR检测结果
• 8.3.4 拟南芥悬浮细胞蛋白质抽提分离试验
• 8.3.5 拟南芥悬浮细胞H3杂交结果
• 8.4 讨论
• 8.4.1 关于 PCR检测的讨论
• 8.4.2 关于免疫杂交的讨论
• 8.4.3 关于H3修饰的讨论
• 8.5 结论
• 参考文献
• 附录
• 附录A GUS基因表达框全序列
• 附录B SAR序列
• 附录C 攻读学位期间主要的学术成果
• 致谢