阳痿肾阳虚证症状规律及其转录组特征研究

论文摘要

研究目的：（1）借助于现代数据挖掘有关技术,对所查找文献与临床范围内的所有记载阳痿肾阳虚证的症状进行统计分析,以期全面客观地总结阳痿肾阳虚证症状特点及规律,为阳痿肾阳虚证的临床诊断及科学研究提供理论依据。（2）基于基因芯片技术,筛选阳痿肾阳虚证患者的转录组学特征,探讨阳痿肾阳虚证的分子生物学基础。研究方法：（1）文献临床研究：以《中华医典》中所有有关的阳痿肾阳虚证的文献记载资料,中国学术期刊全文数据库中有明确描述有关阳痿肾阳虚证的医案,成都中医药大学附属医院及四川生殖医院调查收集的阳痿肾阳虚证的临床病例为研究对象。将上述搜索筛选出来的资料进行症状规范化处理,并根据数据特点和数据挖掘的技术要求建立相应的规则,构建阳痿肾阳虚证症状数据库（同时对典型非肾阳虚证症状也建立数据库,统计分析时作对照用）。运用统计学方法,包括多元回归、频次分析、聚类分析、关联规则等,结合中医药理论,就阳痿肾阳虚证的症状特点及组合规律进行逐层深入的分析。（2）转录组学研究：将临床收集病例中选取的3例典型阳痿肾阳虚证患者和3例健康志愿者,采用基因芯片技术,探讨阳痿肾阳虚证患者的转录组学特征。抽取实验者空腹静脉血10ml,裂解红细胞,分离获得白细胞,Trizol法提取总RNA。将总RNA进行IVT体外扩增,采用cy-3标记扩增后的cDNA,单标法与agilent 4*44k人类全表达谱芯片进行杂交,洗脱、干燥、数据提取、归一化处理。SAM软件挑选差异基因,cutoff范围：P≤0.01,FC≥2。研究结果：（1）通过数据挖掘并结合其它统计分析方法,提取了阳痿肾阳虚证22个最常见症状,并依据统计数据将其排序。这些症状可分为3类：主症4个：阳痿、腰膝酸痛、畏寒肢冷、舌脉（舌质淡胖苔白滑、脉沉细无力）；次症7个：体倦乏力、精神萎靡、腰背发冷、夜尿频多、头晕目眩、性欲减退、面色淡白；一般症状12个：尿后余沥、滑精、不育、纳差食少、遗精、阴冷、脘腹疼痛、大便溏稀、脘腹胀满、精寒、精少、消瘦。（2）阳痿肾阳虚证患者的转录组学研究,筛选出1396个差异表达基因;这些基因的异常表达,与阳痿肾阳虚证患者的主要症状体征密切相关。这些基因主要涉及：蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸酶复合物、调节代谢过程、细胞内的细胞器、大分子代谢过程、转录调节活性、核糖复合物、分子功能的调控、T细胞的选择、转录辅活动、正负代谢调控过程、生物合成过程、多细胞有机体的动态平衡、生长调控,细胞代谢过程、病毒的繁殖过程、白细胞激活,等等。在差异表达基因中,10个蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸酶复合物相关基因表达最为突出,其中5个基因上调,5个基因下调。差异基因涉及多种功能蛋白和代谢通路。主要涉及的信号转导通路有：Alzheimer’s病、代谢途径、N-糖链的合成、泛素介导的蛋白质降解、Wnt信号通路、胰岛素信号转导通路、RIG-I型样受体信号转导通路、MAPK信号转导通路、神经营养因子信号转导通路、钙信号转导通路。上述异常表达基因及相关信号通路,提示阳痿肾阳虚证患者性激素代谢低下、能量合成不足、物质代谢与免疫功能紊乱等,与其主要症状体征密切相关。研究结论：（1）通过对古籍文献、医案及临床调查病例研究,初步揭示了阳痿肾阳虚证的症状特点规律,提出了阳痿肾阳虚证的参考诊断方法。完善了对阳痿肾阳虚证中医证候的认识。（2）通过转录组学研究实验研究,发现10条蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸酶复合物相关基因表达最为突出,其中5条基因上调,5条基因下调。这与以往相关研究有一定区别,这也许能够解释阳痿肾阳虚证的发生可能与蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸酶复合物具有密切关系。（3）阳痿肾阳虚证的病理生理过程复杂,涉及多种功能蛋白和代谢通路。在相关信号通路中,涉及多种信号途径,提示阳痿肾阳虚证的发生有多种信号通路参与,是多种信号通路共同参与的结果。其中,与生殖及生长发育密切相关的Wnt信号通路、对信号转导起整合作用的MAPK通路、促进蛋白质降解的泛素化通路,可能起着相对重要的病理作用。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 英文缩略词表
• 引言
• 第一部分 文献及临床研究
• 1 研究目的
• 2 研究内容
• 3 研究方法
• 3.1 课题设计
• 3.1.1 资料录入
• 3.1.2 纳入标准及排除标准
• 3.1.3 症状提取内容确定及规范
• 3.1.4 数据库的建立
• 3.1.5 数据分析软件
• 3.2 课题的方法学
• 3.2.1 方法——数据挖掘技术
• 3.2.2 数据挖掘方法及其选择
• 4 研究结果
• 4.1 《中华医典》类
• 4.1.1 症状聚类分析结果
• 4.1.2 症状频数与频率分析
• 4.1.3 关联规则分析
• 4.1.4 《中华医典》类结果
• 4.2 期刊医案类
• 4.2.1 资料的收集
• 4.2.2 多元回归统计分析
• 4.2.3 分析组文献症状频数与频率分析
• 4.2.4 关联规则分析
• 4.2.5 统计结果对比分析
• 4.2.6 分析组结果
• 4.3 临床收集病例类
• 4.3.1 资料的收集
• 4.3.2 可比性分析
• 4.3.3 多元回归统计分析
• 4.3.4 分析组频数及关联规则分析
• 4.3.5 分析组症状统计分析结果
• 4.4 三大类综合分析结果
• 5 讨论
• 5.1 四种分析方法在本课题中的应用
• 5.2 研究结果与传统认识差异分析
• 5.3 研究结果与笼统肾阳虚证描述差异比较
• 5.4 分析方法对中医证候诊断标准的意义
• 6 结论
• 第二部分 ED&KDS转录组学研究
• 1 资料
• 1.1 资料来源
• 1.2 病例选择
• 1.2.1 纳入标准
• 1.2.2 排除标准
• 1.3 分组
• 2 实验材料
• 2.1 实验药品及试剂
• 2.2 主要仪器设备
• 3 实验方法及流程
• 3.1 标本的采集与分离白细胞
• 3.1.1 主要试剂与耗材
• 3.1.2 白细胞分离
• 3.2 总RNA提取
• 3.3 总RNA的纯化
• 3.4 cDNA第一链和第二链一步法合成
• 3.5 aaUTP标记cRNA合成
• 3.6 cRNA纯化
• 3.7 cRNA浓度测定
• 3.8 cRNA样品荧光标记
• 3.9 荧光标记cRNA样品纯化
• 3.10 荧光分子浓度及掺入率计算
• 3.11 cRNA样品片段化和芯片杂交（4x44K microarrays）
• 3.12 芯片洗涤
• 3.13 芯片扫描
• 4 实验结果分析
• 4.1 阳痿肾阳虚证差异表达基因
• 4.2 Pathway分析
• 5 讨论
• 5.1 本研究结果与其它ED研究比较分析
• 5.2 本结果与肾阳虚证研究比较分析
• 第三部分 总结与展望
• 1 研究总结
• 1.1 文献及临床研究
• 1.2 转录组学特征研究
• 2 特点与创新
• 2.1 研究方法创新
• 2.2 理论创新
• 2.3 思路创新
• 3 问题与展望
• 3.1 研究方法尚需进一步完善
• 3.2 研究方案及技术路线需再优化
• 3.3 检测技术可进一步优化
• 3.4 宏微观的关联性研究应加强
• 致谢
• 参考文献
• 附件
• 综述1.勃起功能障碍发病机制相关研究新进展
• 参考文献
• 综述2.阳痿肾阳虚证研究概述
• 参考文献
• 在读期间公开发表的学术论文、专著及科研成果