抗水稻黄单胞菌深海独岛枝芽胞杆菌A493及其活性物质研究

论文摘要

人们已经对陆地微生物活性次级代谢产物进行了广泛的研究,而对海洋微生物相关方面的研究还比较欠缺。相对于陆地微生物,海洋微生物生活在非常特殊的环境中,其代谢产物的多样性和代谢途径的独特性决定了海洋微生物次级代谢产物具有新颖的结构和特异的生物活性。本研究从海洋微生物中筛选具有抗植物病原菌作用的菌株,并对其中一株深海独岛枝芽胞杆菌（Virgibacillus dokdonensis）进行抗菌化合物分离鉴定研究工作。以水稻黄单胞菌等为指示菌,采用平板对峙法对411株海洋细菌进行了抗菌筛选,初筛获得具有抗菌活性的海洋菌株81株,复筛获得具有稳定抗菌活性的菌株7株,最后通过测定抗菌谱,得到一株抗菌谱特异并且稳定拮抗水稻黄单胞菌的深海独岛枝芽胞杆菌（V. dokdonensis A493）。A493产抗菌活性物质可以耐受100℃的高温,在pH4-10和紫外照射环境中活性稳定,可以通过3 kDa的超滤管,并且对蛋白酶不敏感。该物质具有很强的极性,只能溶解在水和甲醇中。酸沉淀和硫酸铵沉淀实验结果排除了活性物质是脂肽类物质的可能性。通过离子交换色谱法提取,再经两次薄层层析硅胶板回收分离,得到了精制样品。经过LC-MS分析,初步判断活性物质分子量为317 Da；经Doskochilova溶剂系统纸层析验证,该物质与链霉素的纸层析图谱极为相近；其紫外吸收为末端吸收,茚三酮显色法显示黄色。一般氨基糖苷类物质分子量是大于400 Da的,结合该物质抗菌谱的特异性和产生菌分离环境的特殊性,表明该活性物质极有可能是一种新型的氨基糖苷类抗生素,初步命名为ZH-11。对A493产活性物质ZH-11发酵条件进行了初步优化,使其单位体积发酵液抑菌效果提高18%。活性物质ZH-11相对效价测定的实验表明,A493发酵无菌上清液对水稻黄单胞菌的抑菌效果相当于15.6μg/ml的标准链霉素。对水稻白叶枯病害的温室实验表明,经过A493无菌上清液处理,水稻生长20d后对水稻白叶枯病害防治效果达到了66.7%,且对水稻的正常生长无不良影响。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 植物侵染性病害概况
• 1.1.1 细菌性植物病害
• 1.1.2 真菌性植物病害
• 1.1.3 病毒性植物病害
• 1.1.4 线虫性植物病害
• 1.2 水稻白叶枯病的危害及防治概况
• 1.2.1 抗病种质资源防治
• 1.2.2 农业防治
• 1.2.3 化学防治
• 1.2.4 生物防治
• 1.3 海洋微生物活性物质的研究进展
• 1.3.1 海洋微生物是活性物质的主要来源
• 1.3.2 海洋微生物活性物质的主要分类
• 1.3.2.1 生物碱类
• 1.3.2.2 氨基糖苷类
• 1.3.2.3 肽类
• 1.3.2.4 大环内酯类
• 1.3.2.5 含硫和含卤类
• 1.3.2.6 萜类
• 1.3.2.7 醌类
• 1.3.2.8 杂环类
• 1.3.2.9 其他类型化合物
• 1.4 海洋枝芽胞杆菌属细菌的研究进展
• 1.5 本课题的研究目的及意义
• 2 实验材料与方法
• 2.1 病原指示菌
• 2.2 海洋菌株
• 2.3 培养基
• 2.4 实验主要仪器以及试剂
• 2.5 海洋拮抗细菌筛选
• 2.5.1 植物病原菌培养方法
• 2.5.2 海洋细菌培养方法
• 2.5.3 拮抗菌株初筛
• 2.5.4 拮抗菌株复筛
• 2.5.5 抑菌谱测定
• 2.6 深海独岛枝芽胞杆菌A493产活性物质性质研究
• 2.6.1 活性物质传代稳定性研究
• 2.6.2 温度处理
• 2.6.3 酸碱处理
• 2.6.4 紫外照射处理
• 2.6.5 蛋白酶处理
• 2.6.6 超滤判断分子量大小
• 2.6.7 样品的有机溶剂溶解性
• 2.6.8 酸沉淀和硫酸铵沉淀处理
• 2.7 A493产活性物质的分离纯化和鉴定
• 2.7.1 活性物质制备
• 2.7.2 活性物质粗提取
• 2.7.3 离子交换法分离
• 2.7.4 硅胶板分离
• 2.7.5 活性物质的Doskochilova系纸层统析
• 2.7.6 苯磺酸型固相萃取柱净化
• 2.7.7 LC-MS
• 2.8 A493发酵条件的初步优化
• 2.8.1 种子液及发酵液制备
• 2.8.2 发酵条件单次单因子实验
• 2.8.2.1 不同接种菌龄对活性物质产量的影响
• 2.8.2.2 不同接种量对活性物质产量的影响
• 2.8.2.3 不同发酵时间对活性物质产量的影响
• 2.8.2.4 不同发酵温度对活性物质产生量的影响
• 2.8.2.5 不同装液量对活性物质产生量的影响
• 2.8.2.6 不同摇床转速对活性物质产生量的影响
• 2.8.3 抗菌活性与菌体生长的关系
• 2.8.4 活性物质相对效价的测定
• 2.9 A493温室生物防治实验
• 2.9.1 水稻栽培
• 2.9.2 病原菌及生防样品制备
• 2.9.3 温室实验
• 3 结果与分析
• 3.1 筛选结果
• 3.1.1 初筛结果
• 3.1.2 复筛结果
• 3.1.3 抗菌谱测定
• 3.2 海洋独岛枝芽胞杆菌A493产活性物质特性
• 3.2.1 A493传代稳定性
• 3.2.2 对温度敏感性
• 3.2.3 对酸、碱的敏感性
• 3.2.4 对紫外线敏感性
• 3.2.5 对蛋白酶的敏感性
• 3.2.6 分子量大小的判定
• 3.2.7 活性物质在有机溶剂中溶解性
• 3.2.8 酸沉淀和硫酸铵沉淀处理
• 3.3 A493产活性物质的分离纯化和鉴定
• 3.3.1 阳离子交换法分离结果
• 3.3.2 阴离子交换法分离结果
• 3.3.3 薄层层析分离结果
• 3.3.4 苯磺酸型固相萃取柱净化
• 3.3.5 活性物质的Doskochilova系统纸层析
• 3.3.6 电喷雾质谱结果
• 3.4 A493发酵条件优化结果
• 3.4.1 发酵条件单次单因子实验
• 3.4.1.1 不同接种菌龄对活性物质ZH-11产量的影响
• 3.4.1.2 不同接种量对活性物质ZH-11产量的影响
• 3.4.1.3 不同发酵时间对活性物质ZH-11产量的影响
• 3.4.1.4 不同发酵温度对活性物质ZH-11产生量的影响
• 3.4.1.5 不同装液量对活性物质ZH-1 1产生量的影响
• 3.4.1.6 不同摇床转速对活性物质ZH-11产生量的影响
• 3.4.2 优化条件的确定以及优化效果
• 3.4.3 抗菌活性与菌体生长的关系
• 3.4.4 活性物质ZH-11相对效价的测定
• 3.5 温室实验结果
• 4 总结和展望
• 参考文献
• 致谢