高速逆流色谱法分离制备蜂毒肽

论文摘要

高速逆流色谱（high-speed counter-current chromatography,简称HSCCC）是一种新型的利用液-液分配原理进行分离的一种色谱技术。其不使用固体作为载体,避免了固相载体的不可逆吸附和峰形拖尾等不利现象。可以粗品直接进样,可以实现分离纯化与制备同步完成。目前高速逆流色谱已广泛的运用于天然产物、海洋活性成分、无机物、抗生素等物质的分离纯化中。蜂毒是工蜂用其螯针刺敌时分泌的一种毒汁,其成分十分复杂,主要为肽类、酶类及非肽类物质。其中蜂毒肽是蜂毒主要组成成分及活性成分,是一种含有26个氨基酸残基的阳离子抗菌肽。其能抗炎、镇痛、抑制血小板凝集。但由于蜂毒中成分复杂且多呈碱性,因此从粗蜂毒中纯化蜂毒肽比较困难。目前国内外多采用多步层析的方法制备纯化蜂毒肽,其过程繁琐,成本高,所得制品需要样品前处理及后续处理。本文采用高速逆流色谱方法,建立一种新的分离蜂毒肽方法,鉴定了所得产物的分子量及氨基酸一级结构,证明分离所得物质为蜂毒肽。此方法降低了成本,样品无需前处理,所得产物不需后续处理,增加了一次分离量。根据蜂毒肽的极性及理化性质,参考国内外溶剂体系比例组成,选择了多种溶剂体系进行初步选择,最后总结了五种可参考数据的溶剂体系:正己烷/甲醇/水、正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水、苯/乙酸乙酯/甲醇/水、氯仿/甲醇/水,氯仿/甲醇/水（醋酸）。比对了这五种体系的不同比例组合的K值和分层时间后,选择了正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水体系的1/1/1/1（v/v）、1/6/1.5/7.5（v/v）及3/7/5/5（v/v）三种比例组份体系;苯/乙酸乙酯/甲醇/水的1/1/1/1（v/v）体系;氯仿/甲醇/水的1/1/1/1（v/v/v）及4/3/2（v/v/v）体系;以及氯仿/甲醇/水（醋酸0.2mol/L）的1/1/1（v/v/v）及4/3/2（v/v/v）体系。考察这些体系的固定相保留率、HSCCC平衡时间及是否出峰,保留了正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水的3/7/5/5（v/v）体系。对此体系进行分离条件优化,得到最佳分离条件:HSCCC螺旋管转数为850rmp、流动相流速为1mL/min及循环水浴温度为25℃。最后对HSCCC分离产物进行分子量测定,所得分析量为2845,并根据一级结构的鉴定得知所得分离产物为蜂毒肽。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 课题研究背景
• 1.2 高速逆流色谱
• 1.2.1 高速逆流色谱原理
• 1.2.3 高速逆流色谱最新研究进展及其应用
• 1.3 蜂毒肽
• 1.3.1 蜂毒肽结构
• 1.3.2 蜂毒肽的生物活性
• 1.3.3 蜂毒肽的生理功能
• 1.3.4 蜂毒肽分离方法
• 1.4 本课题的研究目的及意义
• 1.5 本课题主要研究内容
• 第2章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验设备
• 2.3 标准对照样品及样品溶液制备
• 2.3.1 标准对照样品制备
• 2.3.2 样品溶液制备
• 2.4 分配系数及固定相保留率测定
• 2.4.1 分配系数测定
• 2.4.2 固定相保留率测定
• 2.5 蜂毒肽分离的溶剂体系选择
• 2.5.1 紫外分光法筛选溶剂体系
• 2.5.2 HSCCC法筛选溶剂体系
• 2.6 蜂毒肽的制备
• 2.6.1 分离条件优化
• 2.6.2 蜂毒肽的分离
• 2.6.3 分离产物鉴定
• 第3章 蜂毒肽分离的溶剂体系选择
• 3.1 紫外分光法筛选溶剂体系
• 3.1.1 正己烷/甲醇/水体系
• 3.1.2 正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水体系
• 3.1.3 苯/乙酸乙酯/甲醇/水体系
• 3.1.4 氯仿/甲醇/水体系
• 3.1.5 氯仿/甲醇/水（醋酸）体系
• 3.1.6 双水相体系
• 3.2 HSCCC法筛选溶剂体系
• 3.2.1 正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水体系
• 3.2.2 苯/乙酸乙酯/甲醇/水体系
• 3.2.3 氯仿/甲醇/水体系
• 3.3 HSCCC加标准对照样品筛选
• 3.4 本章小结
• 第4章 蜂毒肽的制备
• 4.1 分离条件优化
• 4.1.1 工作温度的选择
• 4.1.2 流动相流速的选择
• 4.1.3 HSCCC螺旋管转速的选择
• 4.2 蜂毒肽的分离
• 4.3 HSCCC方法的精确度及准确度
• 4.4 分离产物鉴定
• 4.4.1 分离产物的质谱分析
• 4.4.2 分离产物的氨基酸序列测序
• 4.5 本章小结
• 结论
• 附图
• 参考文献
• 感谢