宫颈癌组织中RASSF1A基因的甲基化状态及其临床意义

论文摘要

背景与目的宫颈癌是威胁全球女性健康的第二大妇科恶性肿瘤,在发展中国家其发病率位居妇科肿瘤首位,且近些年来具有年轻化趋势。据估计,在全球范围内每年宫颈癌新发确诊病例约49万,死亡人数约27万。现已证实HPV感染是宫颈癌发生的必要条件,但是仅有HPV感染不足以使正常细胞转变为肿瘤细胞。近些年来,表遗传学的修饰在肿瘤形成过程中的作用成为目前研究的热点,其主要包括DNA甲基化和组蛋白去乙酰化。由于基因启动子区甲基化是肿瘤发生的早期事件,并在多种肿瘤的癌前病变中经常出现,因此DNA甲基化有可能成为肿瘤早期诊断的分子生物学方法。RAS相关区域家族1A （Ras associated domain family 1A,RASSF1A）基因是一种肿瘤候选抑癌基因,其启动子区甲基化与多种人类上皮性肿瘤的发生有关,如肺癌、乳腺癌、胃癌、食管癌等。本研究通过检测宫颈癌组织中RASSF1A基因启动子区甲基化状态及其蛋白表达情况,以分析RASSF1A基因甲基化与基因失活的相关性,并探讨RASSF1A基因甲基化与宫颈癌发生的关系,为宫颈癌的发病机制和早期诊断提供理论依据。材料和方法1研究对象收集2008年10月一2009年12月在郑州大学第一附属医院妇科治疗的宫颈癌患者手术切除或门诊活检的新鲜标本60例。临床分期（FIGO,2000）：Ⅰ期25例,Ⅱ期24例,Ⅲ-Ⅳ期11例；组织学类型：鳞癌46例,腺癌14例；组织学分级：Gl～G2 39例,G3 21例；伴有淋巴结转移者7例。患者中位年龄42岁（25-67岁）。所有标本均经病理检查确诊,术前未接受放、化疗。另选取正常宫颈组织15例作为对照。将每一份标本均分为两份,一份切下后立即置冰盒中,然后转入-80℃冰箱保存；另一份用4%甲醛溶液固定,常规石蜡包埋,用于免疫组织化学染色。2实验方法2.1甲基化特异性PCR （MSP）MSP的基本原理是基因组DNA经亚硫酸氢盐处理后,所有发生甲基化的胞嘧啶不产生脱氨基反应,而未发生甲基化的胞嘧啶（C）发生脱氨基反应变为尿嘧啶（U）。基于此种碱基的改变,分别设计出甲基化和非甲基化特异性引物,再结合PCR扩增就可以将甲基化和非甲基化基因区分开来。2.2免疫组织化学染色采用卵白素-生物素-辣根过氧化物酶复合物法即ABC法检测RASSFIA蛋白的表达情况,鼠抗人RASSFIA单克隆抗体的工作液浓度为1：500（美国eBioscience公司）。3统计学分析所有数据采用SPSS 16.0软件包进行处理。x2检验、Fisher精确概率法、Spearman等级相关分析进行统计学分析。检验水准α=0.05或校正的α’=0.017。结果1 RASSFIA基因的甲基化状况及其与宫颈癌临床病理特征的关系15例正常宫颈组织中未见RASSFIA基因甲基化,60例宫颈癌组织中有21例存在RASSFIA基因甲基化,甲基化阳性率35.0%,差异具有显著性（P<0.05）。宫颈鳞癌的RASSFIA基因甲基化率明显高于宫颈腺癌（P<0.05）；临床Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ-Ⅳ期的RASSFIA基因甲基化率呈逐渐升高趋势（16.0%→41.7%→63.6%,P<0.05）,其中,Ⅲ-Ⅳ期的RASSFIA基因甲基化率明显高于Ⅰ期（P<0.017）; RASSFIA基因甲基化与宫颈癌的组织学分级和淋巴结转移无关（P＞0.05）。2 RASSFIA蛋白的表达情况及与RASSFIA基因甲基化的关系正常宫颈组织中均有RASSFIA蛋白的表达,而宫颈癌组织中蛋白阳性表达率仅为48.3%,二者比较差异具有显著性（P<0.05）。宫颈鳞癌的RASSFIA蛋白表达率显著低于宫颈腺癌（P<0.05）；临床Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ～Ⅳ期的RASSFIA蛋白表达呈逐渐降低趋势（72.0%→37.5%→18.2%,P<0.05）,其中,Ⅰ期和Ⅱ期及Ⅲ～Ⅳ期比较均有统计学意义（P<0.017）; RASSFIA蛋白的表达与组织学分级和淋巴结转移无关（P>0.05）。Spearman等级相关分析结果显示,RASSFIA基因甲基化与RASSFIA蛋白表达之间呈负相关（r=-0.500,P<0.05）。结论1宫颈癌组织中存在有RASSFIA基因启动子区的异常高甲基化,且RASSFIA基因有纯合型甲基化和杂合型甲基化两种形式,提示RASSFIA基因甲基化与宫颈癌的发生有关,且是宫颈癌的频发事件。2 RASSFIA基因启动子区的异常高甲基化多见于临床分期晚的宫颈鳞癌组织中,提示RASSFIA基因甲基化可能与宫颈癌细胞的浸润和转移有关。3宫颈癌组织中RASSFIA基因启动子区的甲基化是导致RASSFIA基因失活的重要机制之一。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 引言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述 RASSF1A基因与肿瘤的研究进展
• 参考文献
• 附图
• 个人简历及在学期间发表的学术论文与研究成果
• 致谢