葡激酶T细胞表位区域18-34关键氨基酸突变对其生物学活性的影响

论文摘要

天然葡激酶（staphylokinase, Sak）是一种由金黄色葡萄球菌合成的具有纤溶酶原激活活性的单链蛋白质,由136个氨基酸所组成,分子中不含二硫键,分子量为15.5kD。临床治疗急性心肌梗塞的研究表明,重组葡激酶（r-Sak）具有与重组组织型纤溶酶原激活剂（rt-PA）相当的溶栓活性,且具有更高的纤维蛋白专一性,除此之外,它还能在大肠杆菌中高效表达,生产成本较低,是一种很有应用前景的溶栓药物。但是Sak是一种细菌来源的蛋白质,在临床用药后的两到三周会产生大量的中和性抗体,病人体内将产生免疫反应,甚至发生过敏反应,一定程度上影响了葡激酶在临床上的广泛应用。用定点突变的方法对Sak分子进行改造,去除其抗原表位,是获得新型低免疫原性溶栓药物的重要方法之一。根据报道葡激酶的T细胞表位与HLA-DR结合的区域主要有六个,分别是18-34表位区域、44-57表位区域、73-87表位区域、89-99表位区域、111-120表位区域和125-135表位区域。其中以Y24为核心氨基酸的18-34表位区域对葡激酶结合HLA-DR至关重要,因此本文主要研究葡激酶T细胞表位区域18-34关键氨基酸突变对其生物活性的影响,从而筛选一种纤溶活性高、免疫原性低的突变体。采用QuickChang定点突变PCR法,对葡激酶T细胞表位区域18-34的锚定氨基酸Y24以及它附近的位点进行突变,得到Sak（Y24A）、Sak（Y24V）、Sak（Y24I）、Sak（Y24L）、Sak（V27A）、Sak（N28A）和Sak（V29A）等突变体,并使它们在大肠杆菌DH5a中高效表达,各葡激酶突变体的表达量均占菌体总蛋白量的40%以上,采用阳离子交换层析、分子筛和阴离子交换层析连续三步层析工艺纯化表达产物,结果显示,三步层析纯化后,凝胶扫描显示其纯度均大于95%,HPLC分析其纯度均超过97%。下一步对所得的葡激酶突变体的稳定性、纤溶活性和免疫原性进行了系统研究。用酪蛋白平板法测定各葡激酶突变体纤溶活性,结果显示Sak（N28A）和Sak（V29A）保持了与Wt-sak相当的纤溶活性（80%以上）,Sak（V27A）的纤溶活性降低到了Wt-sak的50%,其余的纤溶活性非常低。将Sak（V27A）、Sak（N28A）和Sak（V29A）免疫小鼠后,用ELISA检测各突变体的特异性抗体水平,发现突变体产生的抗体均显著下降（p<0.05）,其抗体的生成量与Wt-sak相比分别下降了近13%、16%和10%。Sak（V27A）、Sak（N28A）和Sak（V29A）刺激Balb/c小鼠T细胞增殖的能力与Wt-sak相比均明显减弱。■本研究从构建的7个突变体中,筛选到的突变体Sak（N28A）和Sak（V29A）这两个葡激酶突变体既降低了免疫原性又保持了与Wt-sak相当的活性,为进一步构建新型的低免疫原性突变体奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 1 文献综述
• 1.1 药用蛋白质的种类
• 1.1.1 人体自身所缺失的蛋白
• 1.1.2 细菌所产生的蛋白
• 1.1.3 细胞因子
• 1.2 药用蛋白质的免疫原性
• 1.3 临床评估药用蛋白质的免疫原性
• 1.3.1 抗体的监测
• 1.3.2 传统的动物模型
• 1.3.3 T细胞体内激活分析
• 1.4 降低药用蛋白质的免疫原性
• 1.4.1 聚乙二醇（PEG）修饰药用蛋白质
• 1.4.2 去除药用蛋白质的T细胞表位
• 1.4.3 药用蛋白质的人源化
• 1.5 展望
• 2 葡激酶T细胞表位区域18-34关键氨基酸的筛选
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 实验方法
• 2.2 结果与讨论
• 2.2.1 葡激酶T细胞表位区域18-34关键氨基酸的筛选
• 2.2.2 低免疫原性葡激酶突变体表达载体的构建
• 2.2.3 葡激酶突变体重组蛋白的诱导表达
• 2.2.4 突变体蛋白的活性的测定
• 2.2.5 SWISS-MODEL模拟葡激酶突变体的空间结构
• 2.3 小结
• 3 低免疫原性葡激酶突变体表达、纯化与理化性质的分析
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 实验方法
• 3.2 结果与讨论
• 3.2.1 重组蛋白的分离纯化
• 3.2.2 HPLC检测突变体的纯度
• 3.2.3 葡激酶突变体纤溶活性的测定
• 3.2.4 葡激酶突变体细菌内毒素的测定
• 3.2.5 葡激酶突变体蛋白稳定性的测定
• 3.3 小结
• 4 低免疫原性葡激酶突变体的免疫原性分析
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 实验方法
• 4.2 结果与讨论
• 4.2.1 间接ELISA法检测小鼠血清中葡激酶抗体的含量
• 4.2.2 突变体的抗体反应性检测
• 4.2.3 葡激酶突变体刺激淋巴细胞增殖
• 4.3 小结
• 结论
• 存在问题与下一步研究方向
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读学位期间取得的科研成果清单