玉米海藻糖含量测定及其合成酶基因的克隆与序列分析

论文摘要

玉米是我国主要粮食作物之一,同时也是需水较多、对水分胁迫比较敏感的作物。干旱对玉米等农作物所造成的损失在所有非生物胁迫中居首位。我国每年约有60%的玉米面积受到干旱胁迫,因旱灾而减产达15%-20%。因此,研究玉米耐旱机理,弄清玉米对干旱的适应和调节机制,开发玉米耐旱新材料,是减少干旱对玉米生产影响的有效措施。耐旱植物卷柏在干旱条件下,体内大量合成的海藻糖具有保护细胞内活性物质的功能,以降低逆境对细胞造成的伤害;在其他高等植物如拟南芥、水稻等植物中,也发现海藻糖的存在并与干旱存在相关性。目前已有研究者将活性较高的外源海藻糖相关合成酶基因转入水稻、拟南芥、烟草等植物中,使植物耐旱抗逆性得到提高。本试验采用高效液相色谱法测定了玉米、小麦和卷柏叶片中的海藻糖,其中卷柏体内海藻糖的含量达10.31mg/g干重;而在玉米和小麦中未能检测出海藻糖。本试验以水稻TPS的cDNA序列为探针,对玉米EST数据库进行同源检索,通过DNASTAR软件的Seqman程序对同源性序列进行拼接组装,根据拼接序列设计特异引物,采用RT-PCR方法对序列进行验证:然后用cDNA末端快速扩增技术扩增序列的5’端,最后得到了一条长3055bp的cDNA全序列,命名为ZmTPS,GenBank登录号为EU659122。序列分析表明,该序列具有完整的末端结构,并含有一个2691bp的完整阅读框,编码897个氨基酸。通过比对分析,发现ZmTPS对应的氨基酸序列与拟南芥、水稻TPS氨基酸序列的相似性分别达52.26%和41.56%;ZmTPS具有TPS保守功能域和糖基转移酶模体,以及与合成海藻糖底物相结合的保守氨基酸如:Asp130、His154、Arg300等。在卷柏和拟南芥TPS氨基酸序列中存在突出的N端结构,这部分序列起到抑制TPS活性的功能（Van Dijck et al,2002）,而玉米ZmTPS中也存在类似的N端结构;另外在玉米等海藻糖含量较低的植物中,其TPS序列均缺失了部分重要氨基酸,如Gly-Gly-Leu保守模体和一些与底物相结合的位点。这些因素可能影响了玉米体内TPS的活性,使得其海藻糖含量很低。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.1 海藻糖的理化性质
• 1.2 海藻糖的合成途径
• 1.2.1 TPS-TPP途径
• 1.2.2 TreY-TreZ途径
• 1.2.3 TreS途径
• 1.2.4 TSase途径
• 1.3 海藻糖的降解途径
• 1.4 海藻糖的功能
• 1.4.1 逆境下海藻糖对生物体的保护作用
• 1.4.2 海藻糖可能起调节因子作用
• 1.4.3 海藻糖的其他作用
• 1.5 海藻糖保护生物分子的机理
• 1.5.1 “水替代”假说
• 1.5.2 “玻璃态”假说
• 1.5.3 “化学稳态”假说
• 1.6 海藻糖合成酶（TPS、TPP）的研究
• 1.6.1 TPS的研究情况
• 1.6.2 TPP的研究情况
• 1.7 海藻糖的检测方法
• 1.7.1 高效液相色谱法
• 1.7.2 气相色谱─质谱法
• 1.8 EST与RACE技术
• 1.8.1 表达序列标签（EST）
• 1.8.2 cDNA末端快速扩增法（RACE）
• 1.9 目的与意义
• 2 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 主要仪器设备
• 2.1.3 主要药品和试剂
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 干旱试验设计
• 2.2.2 进行HPLC分析前的样品处理
• 2.2.3 HPLC仪器条件
• 2.2.4 网络资源及应用软件
• 2.2.5 基因克隆
• 2.2.6 蛋白质性质分析与结构预测
• 3 结果与分析
• 3.1 海藻糖的检测
• 3.2 玉米叶片总RNA的提取
• 3.3 电泳结果
• 3.4 测序结果及序列分析
• 3.4.1 物种间TPS氨基酸序列的比对
• 3.4.2 玉米与其他物种TPS序列的遗传分析
• 3.4.3 玉米与其他物种TPS蛋白质结构的相似性比较
• 4 讨论
• 4.1 HPLC检测海藻糖
• 4.1.1 流动相的比例
• 4.1.2 样品的处理
• 4.1.3 进样量的选择
• 4.1.4 柱温的选择
• 4.1.5 检测器的影响
• 4.2 玉米ZmTPS的克隆
• 4.2.1 序列克隆
• 4.2.2 5'端RACE及引物设计
• 4.3 影响海藻糖含量及TPS活性的因素
• 小结
• 参考文献
• 致谢
• 附录 玉米ZmTPS cDNA全序列