绿色木霉葡聚糖内切酶Ⅰ基因在大肠杆菌中的表达与分子改造

论文摘要

纤维素可以在纤维素酶系的作用下降解成葡萄糖,而葡萄糖又能用于生产一种新型清洁能源:燃料乙醇。在这个转化途径中,纤维素酶降解纤维素成葡萄糖是最大的瓶颈,因此构建高效表达纤维素酶的基因工程菌并获得高酶活的纤维素酶,对今后纤维素的发酵生产应用具有重要的意义。本研究使绿色木霉内切葡聚糖酶Ⅰ顺利地在大肠杆菌中获得表达,对该酶进行纯化并测定其酶学性质,研究发现在大肠杆菌中表达出的重组酶在以羧甲基纤维素纳（CMC-Na）作为底物时,其比活为3.8U/mg、Km为18.62mg/mL、Vmax为32.53μmol/min、其催化效率Kcat/Km为1.03 ml/mg.s、其最适反应温度约为48℃、最适反应pH值约为5.2、其Tm值在60℃附近。本研究还通过同源比比对法,确定了以与绿色木霉内切葡聚糖酶Ⅰ氨基酸序列相似性达到99%的瑞氏木霉内切葡聚糖酶Ⅰ的蛋白质3D结构为参考,预测并选择了绿色木霉内切葡聚糖酶Ⅰ的酶活性中心位点Glu217、Glu222进行定点突变,将其定向突变为Asp,而对活性中心位点Asp219位点进行定点饱和突变,并辅助结合蛋白质结构分析软件prosa2003对其进行能量计算,通过分析计算结果,选择了保守区的Pro366、Asp242、Pro198三个氨基酸位点进行定点随机突变。而后又通过多序列同源比对法,选择了非保守区的Gly291氨基酸位点进行定点随机突变通过筛选,最终只筛训揭恢暧忻富畹耐槐涿窯291S,即Gly突变为Ser,纯化并测定了该突变酶的酶学性质并与野生型酶进行了比较,该突变酶以羧甲基纤维素（CMC-Na）为底物时,其比活为野生型酶的2.2倍,达到8.3U/mg;Km值下降至12.34mg/mL,为野生型酶的0.66倍;其Vmax为40.04μmol/min,与野生型酶相比较没有明显的提高;其催化效率Kcat/Km达到2.03 ml/mg.s,为野生型酶的1.97倍;其最适反映温度和最适反应pH值没有发生改变;而其Tm值降至55℃至60℃之间。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 1.1 燃料乙醇与纤维素
• 1.2 纤维素与纤维素酶
• 1.2.1 纤维素的结构
• 1.2.2 纤维素的应用现状
• 1.2.3 纤维素酶系与降解纤维素机理
• 1.2.4 内切葡聚糖酶的分子结构
• 1.3 纤维素酶基因工程菌的发展
• 1.3.1 纤维素酶基因工程菌的发展现状
• 1.3.2 大肠杆菌表达纤维素酶的研究意义
• 1.4 酶分子定向进化技术与纤维素酶
• 1.4.1 酶分子定向进化技术
• 1.4.2 定向进化技术的选择
• 1.5 本实验的研究目的与步骤
• 1.5.1 本实验的研究目的
• 1.5.2 本实验的技术路线
• 第二章 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株与质粒
• 2.1.2 酶与试剂
• 2.1.3 主要仪器设备
• 2.1.4 培养条件
• 2.1.5 常规试剂、溶液和缓冲液
• 2.2 方法与步骤
• 2.2.1 大肠杆菌感受态的制备
• 2.2.2 质粒DNA的小量制备
• 2.2.3 酿酒酵母质粒的提取
• 2.2.4 引物设计
• 2.2.5 DNA的酶切与连接
• 2.2.6 连接产物对大肠杆菌感受态细胞的转化
• 2.2.7 阳性克隆的筛选
• 2.2.8 重组菌株的平板酶活检测
• 2.2.9 重组菌株的液体诱导表达
• 2.2.10 外源基因在大肠杆菌中的表达检测
• 2.2.11 蛋白质的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 2.2.12 EGI酶的纯化
• 2.2.13 葡聚糖内切酶的活力测定
• 2.2.14 葡萄糖标准曲线的制作
• 2.2.15 蛋白质浓度测定
• 2.2.16 内切葡聚糖酶定点突变库的构建
• 2.2.17 野生型和突变酶动力学性质测定
• 第三章 结果与分析
• 3.1 野生型eg1基因在大肠杆菌中的表达
• 3.1.1 表达重组质粒的构建
• 3.1.2 绿色木霉EG1的酶活验证
• 3.2 绿色木霉EGⅠ突变体的构建
• 3.2.1 突变位点的选定
• 3.2.2 突变酶的平板筛选
• 3.3 酶的纯化、鉴定和酶学性质研究
• 3.3.1 酶的纯化
• 3.3.2 野生酶和突变酶酶学性质比较
• 3.3.3 酶反应的最适温度
• 3.3.4 酶反应的最适pH
• 3.3.5 酶的热稳定性的测定
• 第四章 讨论
• 4.1 定点突变点的确定
• 4.2 突变位点的结果分析
• 第五章 结论与展望
• 5.1 结论
• 5.2 问题与展望
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的论文