可控酵母致突变菌株的构建及其在瑞氏木霉内切纤维素酶EGⅢ体内定向进化中的应用

论文摘要

目前致突变菌株（mutator strain）的使用是蛋白质定向进化中所采用的一种体内分子生物学方法。多数致突变菌株的构建都是通过破坏正常细胞的DNA复制和修复过程中的关键酶基因，使正常的DNA复制过程受到影响，忠实性和正确性降低，当外源目的基因转入到构建好的致突变菌株中时，发生随机突变的几率远远高于野生型，再通过有选择性的筛选，获得符合要求的突变子。因此，致突变菌株就是一种体内定向进化的突变系统和工具。 原核生物致突变菌株的研究目前已经很成熟，并且商品化。比如Stratagene公司生产的大肠杆菌XL1 Red Competent cell。通过分子生物学的方法使XL1 Red的DNA修复过程中的三个酶基因（错配修复基因、DNA聚合酶Ⅲ 3′—5′核酸外切酶基因和8-oxodGTP水解酶基因）缺失，导致DNA复制过程的忠实性和正确性降低，这使得XL1 Red致突变菌株的随机突变率是野生型的5000倍。该致突变菌株的优点在于可以在体内使目的基因发生随机突变，并且无需大量的遗传学和分子生物学操作。 虽然以大肠杆菌XL1 Red为代表的原核生物致突变菌株在体内定向进化中取得了一些结果，但是大多数的致突变菌株不能够根据需要控制合适的突变率，同时作为原核生物表达系不适合某些真核生物蛋白的表达，这些因素限制了该项技术的广泛应用。为克服传统致突变菌株的这些缺陷，本课题分别敲除了酵母菌RDKY3615（ura3-52，trp1△63，leu2△1，his3△200）中与清除活性氧化物质（reactive oxygen species）有关的三个酶——超氧化物歧化酶SOD、过氧化氢酶CTT和硫氧还蛋白SRX的基因，构建了三株可以通过不同的H2O2诱导处理条件来控制突变率的致突变菌株RDKY3615（Δsod）、RDKY3615（Δctt）、RDKY3615（Δsrx）。 该致突变菌株相对于传统的致突变菌株来说具有两个特点：第一，它是真核生物体系，而真核致突变菌株应用于体内定向进化的研究还未见报道；另外本文所构建的三株致突变菌株是通过敲除掉与清除活性氧化物质有关的三个酶基因

论文目录

• 目录
• 摘要
• Abstract
• 第一章：绪论
• 1.蛋白质定向进化技术
• 1.1 蛋白质定向进化技术原理和研究现状
• 1.2 蛋白质体内定向进化技术
• 2.酿酒酵母的遗传工程
• 3.纤维素酶的分类和工业应用
• 3.1 纤维素结构
• 3.2 纤维素酶分类
• 3.3 纤维素酶结构
• 3.4 纤维素酶应用
• 3.4.1 纺织
• 3.4.2 酿酒
• 3.4.3 饲料
• 3.4.4 其它
• 4.本工作的目的和意义
• 第二章 酿酒酵母致突变菌株的构建及参数测定
• 1 导言
• 2 材料与方法
• 2.1 菌株和质粒
• 2.2 分子克隆用酶和试剂
• 2.3 培养基
• 2.4 DNA常规操作
• 2O₂诱导条件下酵母菌致突变菌株存活率的测定'>2.5 H₂O₂诱导条件下酵母菌致突变菌株存活率的测定
• 2.6 致突变菌株突变率的计算
• 2.6.1 质粒pGADT7—kan的构建
• 2.6.2 点突变使kanamycin抗性基因使之失活
• 2.6.2.1 点突变试剂盒内容
• 2.6.2.2 选择性寡聚核糖核苷酸（Selection oligonucleotides）
• 2.6.2.3 材料准备
• 2.6.2.4 引物与模板杂交
• 2.6.2.5 模板DNA的准备
• 2.6.2.6 杂交反应体系
• 2.6.2.7 合成与连接
• 2.6.2.8 验证感受态细胞效率
• 2.6.2.9 转化感受态细胞BMH 71-18mutS
• 2.6.2.10 提取质粒：
• 2.6.2.11 转化感受态细胞JM109
• 2.6.2.12 转化子测序及抗性的验证
• 2.6.3 致突变菌株kanamycin抗性回复突变率的测定
• 3 结果与讨论
• 3.1 致突变菌株的构建
• 3.2 致突变菌株回复突变率的测定
• 3.2.1 质粒pGADT7—kan的构建
• 3.2.2 点突变kanamycin抗性基因
• 3.2.3 点突变结果验证
• 3.3 kanamycin抗性基因回复突变率的测定
• 2O₂浓度诱导条件下致突变菌株存活率和回复突变率测定'>3.3.1 不同H₂O₂浓度诱导条件下致突变菌株存活率和回复突变率测定
• 2O₂处理时间条件下存活率和回复突变率的测定'>3.3.2 不同H₂O₂处理时间条件下存活率和回复突变率的测定
• 第三章 瑞氏木霉内切纤维素酶基因EGⅢ在致突变菌株中的体内定向进化
• 1 导言
• 2 材料与方法
• 2.1 菌种和质粒
• 2.2 分子克隆用酶和试剂
• 2.3 培养基
• 2.4 DNA操作
• 2.5 表达质粒pGADT7—egⅢ的构建
• 2.5.1 引物设计
• 2.5.2 去磷酸化处理
• 2.5.3 egⅢPCR产物酶切连接构建pGADT7—egⅢ质粒
• 2.5.4 pGADT7—egⅢ质粒的酶切验证
• 2.6 pGADT7—egⅢ转化酿酒酵母致突变菌株
• 2.7 刚果红染色
• 2.9 SDS电泳检测发酵液中内切酶
• 2.10 活性染色
• 2.11 内切酶酶活性测定
• 3 结果与讨论
• 3.1 PCR扩增瑞氏木霉内切纤维素酶EGⅢ基因
• 3.2 pGADT7—egⅢ的构建
• 3.3 pGADT7—egⅢ转化酿酒酵母致突变菌株
• 3.4 刚果红染色筛选
• 3.5 酶活性测定
• 3.6 SDS电泳与活性染色检测目的蛋白
• 3.7 测序
• 参考文献
• 致谢