论文摘要
目的:中药是我国独具优势的传统医药资源,子宫颈癌是严重威胁妇女健康的重大疾病,仅次于乳腺癌的第二个最常见的恶性肿瘤,目前具有年轻化趋势。宫颈癌的发生、发展与HPV感染密切相关。机体免疫系统能产生抗肿瘤免疫应答,但是,肿瘤仍能在机休内进行性生长,这与肿瘤可逃避免疫监视密切相关,其中肿瘤免疫抑制作用是其免疫逃逸机制的重要方面。研究发现,有些肿瘤细胞的培养上清确有免疫抑制作用,而有些抗瘤中药也确有逆转肿瘤上清免疫抑制的作用。CD4+CD25+调节性T淋巴细胞（Treg）具有免疫无能性及免疫抑制性,是肿瘤免疫抑制的重要途径之一。文献报道宫颈癌患者外周血中CD4+CD25+Treg显著升高,三氧化二砷和槲皮素对宫颈癌Hela细胞的抗肿瘤的研究已有报道,但是两种中药是否有逆转肿瘤培养上清免疫抑制作用未见报道,为此,我们体外研究了三氧化二砷和槲皮素对宫颈癌Hela细胞培养上清免疫抑制功能的影响,为研究中药抗瘤新机制和开辟筛选抗瘤中药新途径进一步提供实验依据。方法:1.各种免疫上清的制备分别制备药物作用一定时间后洗去药物,再培养不同时间的肿瘤细胞培养上清。其中,三氧化二砷和槲皮素作用宫颈癌Hela细胞48小时后洗去药物,加入新鲜培养液,重新调整细胞浓度后,再培养48小时的上清分别称为As–S,Qu-S,相应的以完全培养液代替药物同步处理所获的对照培养上清称为Control-S。2.用MTT法检测两种中药培养上清对PHA诱导的外周血淋巴细胞增殖及CTL细胞毒作用的影响。3.用流式细胞术分析两种中药培养上清对外周血T淋巴细胞亚群表型的影响。4.定量ELISA检测两种中药培养上清TGF-β1、VEGF、IL-4、IL-6和IL-10五种免疫抑制因子的含量。5.并对三氧化二砷和槲皮素下调宫颈癌Hela细胞免疫抑制因子分泌与上清免疫抑制功能之间的关系进行分析。6.统计学方法:所有数据采用SPSS13.0统计软件进行分析,实验结果用x±s表示,两两比较用q检验;相关分析行直线回归及直线相关分析;显著性检验水准α=0.05,P<0.05判定为具有统计学差异。结果:1.三氧化二砷作用后的Hela细胞培养上清对外周血淋巴细胞免疫功能的影响1.1三氧化二砷作用后的Hela细胞培养上清较未作用的培养上清对PHA诱导的外周血淋巴细胞增殖、CTL细胞毒作用及CD4+CD25- T细胞的抑制作用均显著降低,而对CD4+CD25+T细胞的抑制作用显著增强1.2三氧化二砷作用后的Hela细胞培养上清较未作用的培养上清中TGF-β1、IL-4和IL-10含量显著降低,而VEGF及IL-6含量无明显改变。1.3其中TGF-β1与抑制PHA诱导的T淋巴细胞增殖和CD25+表达正相关,与CD4+CD25+T细胞表达也成正相关;IL-4与CD4+CD25- T细胞表达及CTL细胞毒作用抑制正相关;VEGF与CTL细胞毒作用抑制亦正相关。2.槲皮素作用后的Hela细胞培养上清对外周血淋巴细胞免疫功能的影响2.1槲皮素作用后的Hela细胞培养上清较未作用的培养上清对PHA诱导的外周血淋巴细胞增殖、CTL细胞毒作用及CD3+、CD4+、CD25+及CD4+CD25- T细胞表达的抑制作用均显著降低,而对人外周血淋巴细胞CD4+CD25+表达的抑制明显增高。2.2槲皮素作用后的Hela细胞培养上清中TGF-B1、IL-6和IL-10含量明显降低,而VEGF及IL-4含量无明显改变。2.3相关分析显示,槲皮素作用后, Hela细胞培养上清对人外周血淋巴细胞转化的抑制和CD25+的表达抑制均与TGF-B1含量正相关;TL细胞杀伤的抑制分别与VEGF和IL-4表达正相关,然而槲皮素作用后Hela细胞培养上清对人外周血淋巴细胞CD4+CD25-的表达抑制与IL-10含量正相关,CD4+CD25+表达与5种免疫抑制分子含量无明显相关性。结论:1.宫颈癌Hela细胞培养上清对人外周血淋巴细胞的免疫功能具有明显抑制作用,其有可能是宫颈癌Hela细胞分泌免疫抑制分子,如TGF-β1和IL-10等, CD4+CD25+调节性T细胞生成增多也可能参与了肿瘤免疫。2.三氧化二砷和槲皮素主要通过调节免疫抑制分子TGF-β1和IL-10分泌逆转宫颈癌Hela细胞的免疫抑制作用,这可能是两种中药抗肿瘤作用的机制之一。3.三氧化二砷和槲皮素可能通过下调CD4+CD25+调节性T细胞的表达,恢复CD4+T细胞抗肿瘤功能及CTL细胞杀瘤活性,达到抑制肿瘤细胞生长的效果,这可能也是两种中药抗肿瘤作用的机制之一。4.可将对肿瘤细胞培养上清免疫抑制作用影响的检测,作为筛选抗肿瘤中药的一种新途径。