新型生物传感技术用于端粒酶活性的检测

论文摘要

端粒酶是一种特殊的DNA聚合酶,具有逆转录酶活性,能以自身的RNA为模板,以端粒3’末端为引物,合成端粒重复单元TTAGGG。在正常人体细胞中,端粒酶的表达较低。但是在恶性肿瘤细胞,端粒酶的表达较高（它能维持癌细胞端粒的长度,使其无限制扩增）。迄今发现近90%的肿瘤细胞都有端粒酶活性,端粒酶是目前最广谱的恶性肿瘤的预警标志物,已成为当今肿瘤诊断的新标志物和肿瘤治疗的新靶点。因此,对端粒酶的检测具有重要意义。（1）第二章中发展了一种利用纳米金放大技术电化学方法用于端粒酶活性的检测。该方法通过在金电极表面组装一条巯基捕获探针（包含端粒酶的引物序列）,在端粒酶的作用下,对捕获探针进行扩增,纳米金标记的DNA探针与扩增序列互补杂交,利用电活性物质亚甲基蓝可以嵌入DNA双链和吸附纳米金表面的特点来实现信号的输出,进而实现对目标物活性的检测。该方法快速准确、操作简单,灵敏度较高。（2）第三章中研制了一种基于外切酶放大的荧光生物传感技术用于端粒酶活性的检测。该方法设计了一条端粒酶的引物探针,一条标记有一个荧光基团和一个猝灭基团的Taqman探针。在端粒酶存在情况下,引物探针进行扩增,扩增序列与Taqman探针可以互补杂交,形成双链。然后用T7核酸外切酶（一种只作用于双链DNA,且沿5’→3’方向催化去除5’单核苷酸）,沿双链5’→3’方向催化去除5’单核苷酸,使荧光基团和猝灭基团分开,从而荧光得到恢复。由于T7核酸外切酶只水解DNA双链的5’单核苷酸,因此端粒酶的扩增序列可以继续结合Taqman探针,可以循环利用,进而实现对信号的循环放大,大大降低了检测下限。该方法具有快速,选择性好,灵敏度高,操作简单和背景干扰较低等优点。（3）蝎型探针是一种特殊的分子信标,它除了具有分子信标特有的高度特异性外,还具有本身的特征——防止扩增产物之间的相互竞争。第四章基于蝎型探针的特点,设计了一种基于探针-靶杂交体的蝎型探针用于端粒酶活性的检测。实验设计了一条标记有荧光基团和猝灭基团的端粒酶引物的蝎型探针链,在退火条件下可以形成发夹信标状,荧光基团和猝灭基团靠近,没有荧光。当有目标物存在时,引物探针在端粒酶作用下进行扩增,其扩增序列能与发夹的环部杂交,于是发夹结构打开,荧光基团和猝灭基团分开,使得荧光恢复,进而实现对端粒酶活性的检测。该方法操作简单,特异性强,灵敏度高。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 端粒及端粒酶
• 1.1.1 端粒的结构
• 1.1.2 端粒的功能
• 1.1.3 端粒酶的结构
• 1.1.4 端粒酶的功能
• 1.2 端粒、端粒酶与细胞衰老及肿瘤的关系
• 1.2.1 端粒与细胞衰老的关系
• 1.2.2 端粒与肿瘤的关系
• 1.2.3 端粒酶与细胞衰老的关系
• 1.2.4 端粒酶与肿瘤的关系
• 1.3 端粒酶的抑制剂
• 1.3.1 直接作用于端粒酶的抑制剂
• 1.3.2 与端粒相关的抑制剂
• 1.3.3 其他抑制剂对端粒酶活性的影响
• 1.4 端粒酶活性的检测
• 1.4.1 检测原理
• 1.4.2 检测方法
• 1.5 本文构思
• 第2章 基于纳米金放大的电化学DNA 传感器用于端粒酶活性检测
• 2.1 引言
• 2.2 实验部分
• 2.2.1 试剂和仪器
• 2.2.2 纳米金的合成
• 2.2.3 纳米金的标记
• 2.2.4 Hela 细胞的培养
• 2.2.5 端粒酶的提取
• 2.2.6 传感器界面的制作
• 2.2.7 端粒酶扩增及其电化学检测
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 电化学检测端粒酶活性的设计原理
• 2.3.2 传感器的电化学响应
• 6^3-/4-溶液中的交流阻抗特性'>2.3.3 传感器在Fe（CN）₆^3-/4-溶液中的交流阻抗特性
• 2.3.4 反应时间对传感器性能的影响
• 2.3.5 盐离子浓度对传感器性能的影响
• 2.3.6 工作曲线
• 2.4 小结
• 第3章 基于核酸外切酶循环放大荧光方法用于端粒酶活性检测
• 3.1 引言
• 3.2 实验部分
• 3.2.1 仪器与试剂
• 3.2.2 Hela 细胞的培养
• 3.2.3 端粒酶的提取
• 3.2.4 端粒酶的扩增反应
• 3.2.5 T7 核酸外切酶酶切反应
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 核酸外切酶循环放大检测端粒酶活性的设计原理
• 3.3.2 传感器的响应
• 3.3.3 反应时间对端粒酶活性的影响
• 3.3.4 荧光各向异性表征
• 3.3.5 液相色谱表征
• 3.3.6 工作曲线
• 3.4 小结
• 第4章 基于蝎型结构探针荧光方法用于端粒酶活性检测
• 4.1 引言
• 4.2 实验部分
• 4.2.1 仪器与试剂
• 4.2.2 Hela 细胞的培养
• 4.2.3 端粒酶的提取
• 4.2.4 端粒酶的扩增及荧光的检测
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 蝎型结构探针检测端粒酶活性的设计原理
• 4.3.2 传感器的响应
• 4.3.3 K+离子浓度对扩增反应的影响
• 4.3.4 实时荧光光谱的表征
• 4.3.5 工作曲线
• 4.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 附录 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢