贵州珍珠半夏的离体培养及遗传稳定性的分子检测

论文摘要

本文以贵州珍贵半夏品种—珍珠半夏为材料,对其离体快繁、适宜于遗传改良的再生体系、愈伤组织培养,以及离体材料的体细胞遗传变异等方面进行了探讨,以期为半夏试管苗的大规模工厂化生产,种质资源的离体保存及遗传转化等提供技术平台。取得以下结果:1建立并优化了珍珠半夏离体快繁体系采用珍珠半夏球茎为外植体,接种在MS+KT（1.0mg/L）+NAA（0.2-0.4mg/L）+蔗糖（3.0%）+琼脂（0.7%）培养基中,可在30d内完成芽的萌发、增殖以及诱导生根等离体快繁的全过程。炼苗约15d后即可定植于大田。2建立并优化了叶柄和叶片的离体培养体系外植体类型、年龄,培养基中生长调节物质（PGR）种类及含量等因子对珍珠半夏再生有很大影响。叶柄接种于MS+BA（0.5 mg/L）+IBA（0.2mg/L）+蔗糖（3.0%）+琼脂（0.7%）的培养基中,获得了较高的不定芽再生频率;暗培养和AgNO3对其不定芽再生率影响不大。珍珠半夏叶片再生的最适培养基为MS+TDZ（0.2mg/L）+IBA（0.2mg/L）+蔗糖（3.0%）+琼脂（0.7%）。3愈伤组织培养外植体类型、基本培养基、生长素种类及浓度对珍珠半夏愈伤组织的诱导有一定影响。以球茎接种在MS+BA（1.0mg/L）+2,4-D（2.0mg/L）+蔗糖（3.0%）+琼脂（0.7%）培养基上,出愈率最高,且可以有效的防止褐化,愈伤组织质量较好,可用于长期继代培养。TDZ对愈伤组织的再分化效果优于BA、KT及ZT,在MS+TDZ（0.2 mg/L）+IBA（0.5mg/L）+蔗糖（3.0%）+琼脂（0.7%）培养基中,分化的不定芽生长状况良好,且能正常生根。4组培材料遗传稳定性的分子检测采用96个随机引物产生的RAPD标记,对田间材料、组培材料第5代、10代和15代的珍珠半夏试管苗DNA进行检测,没有发现变异;采用78个随机引物对珍珠半夏继代第15代内20个株系的DNA进行检测,也未检测到变异。因此在所用引物检测范围内,珍珠半夏试管苗在15代以内DNA分子上没有发现变异。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 第一章 前言
• 1 课题的提出
• 2 研究进展
• 2.1 半夏离体培养的研究进展
• 2.1.1 脱除病毒
• 2.1.2 快速繁殖
• 2.1.3 人工种子
• 2.1.4 种质资源保存
• 2.1.5 细胞悬浮培养
• 2.1.6 愈伤组织培养
• 2.2 半夏遗传转化
• 2.3 离体培养下的体细胞遗传变异
• 2.3.1 影响体细胞遗传变异的因素
• 2.3.1.1 外植体类型
• 2.3.1.2 培养时间
• 2.3.1.3 培养条件
• 2.3.1.4 再生方式
• 2.3.2 体细胞遗传变异的检测方法
• 2.3.2.1 形态学
• 2.3.2.2 细胞学
• 2.3.2.3 同工酶（酶谱分析）
• 2.3.2.4 DNA分子标记
• 2.3.2.5 体细胞遗传变异的检测
• 3 本研究的目的和内容
• 3.1 研究目的
• 3.2 研究内容
• 第二章 半夏的离体培养及遗传稳定性的分子检测
• 1 引言
• 2 材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 无菌系的建立
• 2.2.2 半夏珠芽增殖
• 2.2.2.1 基本培养基与增殖
• 2.2.2.2 碳源与增殖
• 2.2.2.3 细胞分裂素种类与增殖
• 2.2.2.4 KT浓度与增殖
• 2.2.2.5 生长素种类与增殖
• 2.2.2.6 NAA浓度与增殖
• 2.2.2.7 移栽
• 2.2.2.8 主要统计项目
• 2.2.3 叶柄培养
• 2.2.3.1 外植体与不定芽再生
• 2.2.3.2 外植体年龄与不定芽再生
• 2.2.3.3 接种方式与不定芽再生
• 2.2.3.4 细胞分裂素种类与不定芽再生
• 2.2.3.5 卧浓度与叶柄不定芽再生
• 2.2.3.6 IBA浓度与叶柄不定芽再生
• 3浓度与叶柄不定芽再生'>2.2.3.7 AgNO₃浓度与叶柄不定芽再生
• 2.2.3.8 暗处理与叶柄不定芽再生
• 2.2.4 叶片培养
• 2.2.4.1 细胞分裂素种类与叶片不定芽再生
• 2.2.4.2 TDZ浓度与叶片不定芽再生
• 2.2.4.3 IBA浓度与叶片不定芽再生
• 2.2.4.4 统计指标
• 2.2.5 愈伤组织培养
• 2.2.5.1 外植体与愈伤组织诱导
• 2.2.5.2 基本培养基与半夏愈伤组织诱导
• 2.2.5.3 生长素种类与半夏愈伤组织诱导
• 2.2.5.4 2,4-D浓度与半夏愈伤组织诱导
• 2.2.5.5 细胞分裂素与半夏愈伤组织增殖
• 2.2.5.6 2,4-D浓度与半夏愈伤组织增殖
• 2.2.5.7 细胞分裂素与半夏愈伤组织再分化
• 2.2.5.8 TDZ浓度与半夏愈伤组织再分化
• 2.2.5.9 统计指标
• 2.2.6 离体材料遗传稳定性的分子检测
• 2.2.6.1 离体材料总DNA的提取
• 2.2.6.2 DNA的检测
• 2.2.6.3 离体材料遗传稳定性的RAPD检测
• 3 结果与分析
• 3.1 半夏离体快繁体系的建立与优化
• 3.1.1 无菌系试管苗的建立
• 3.1.2 试管苗珠芽增殖
• 3.1.2.1 基本培养基的影响
• 3.1.2.2 碳源对试管苗增殖的影响
• 3.1.2.3 细胞分裂素种类对试管苗增殖的影响
• 3.1.2.4 KT浓度对试管苗增殖的影响
• 3.1.2.5 生长素种类对试管苗增殖的影响
• 3.1.2.6 NAA浓度对试管苗增殖的影响
• 3.1.3 试管苗的移栽
• 3.2 叶柄培养
• 3.2.1 外植体对不定芽诱导的影响
• 3.2.2 外植体年龄对不定芽诱导的影响
• 3.2.3 叶柄接种方式对其不定芽诱导的影响
• 3.2.4 细胞分裂素种类对不定芽诱导的影响
• 3.2.5 BA浓度对叶柄不定芽诱导的影响
• 3.2.6 IBA浓度对叶柄不定芽诱导的影响
• 3浓度对叶柄不定芽诱导的影响'>3.2.7 AgNO₃浓度对叶柄不定芽诱导的影响
• 3.2.8 暗处理对叶柄不定芽诱导的影响
• 3.3 叶片培养
• 3.3.1 细胞分裂素对叶片不定芽诱导的影响
• 3.3.2 TDZ浓度对叶片不定芽诱导的影响
• 3.3.3 IBA浓度对叶片不定芽诱导的影响
• 3.4 愈伤组织培养
• 3.4.1 愈伤组织诱导
• 3.4.1.1 外植体的影响
• 3.4.1.2 基本培养基的影响
• 3.4.1.3 生长素种类对愈伤组织诱导的影响
• 3.4.1.4 2,4-D浓度对愈伤组织诱导的影响
• 3.4.2 愈伤组织增殖培养
• 3.4.2.1 2,4-D浓度对愈伤组织增殖的影响
• 3.4.2.2 细胞分裂素种类对愈伤组织增殖的影响
• 3.4.3 愈伤组织再分化
• 3.4.3.1 细胞分裂素种类对再分化影响
• 3.4.3.2 TDZ浓度对再分化影响
• 3.5 离体材料遗传稳定性的分子检测
• 3.5.1 DNA的提取与检测
• 3.5.1.1 DNA的提取
• 3.5.1.2 DNA的检测
• 3.5.2 遗传稳定性的分子检测
• 3.5.2.1 RAPD-PCR实验体系的建立
• 3.5.2.2 珍珠半夏组培过程中遗传稳定性的RAPD检测
• 4 讨论
• 4.1 保持遗传稳定性的半夏离体快繁体系
• 4.2 适宜于半夏遗传改良的再生体系
• 4.3 半夏愈伤组织培养
• 4.4 半夏离体培养下的遗传变异
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 图版及说明