枯草芽孢杆菌CS27高密度培养及保藏研究

论文摘要

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是我国农业部公布允许使用的15种微生态制剂菌种之一,已经越来越多的被研制成微生物制剂。其制剂是无毒、无污染的环保产品,具有广阔的发展前景,已经广泛应用于畜牧、水产养殖业、饲料行业,显示出巨大的经济、社会效益和生态效益。本课题以实验室前期筛选的枯草芽孢杆菌CS27为出发菌株,研制用于饲用的微生物菌剂。应用正交试验和响应面分析法对CS27摇瓶液体发酵的培养基进行优化,研究了CS27菌株在5L液体发酵罐中最优发酵条件,并对CS27菌剂保藏方法进行初步探讨。课题研究结果如下：（1）采用单因素试验和正交试验方法,对已筛选出的枯草芽孢杆菌CS27菌株进行液体培养基和工艺条件优化。确定了最佳培养基配方为：1.5%糖蜜、1.5%黄豆粉、0.5%氯化铵、1.0%NaCl、0.1%MgSO4·7H2O、0.1%柠檬酸钠、0.5%碳酸钙；最佳发酵条件为：发酵温度32℃,初始pH值7.0,最适接种量10%（v/v）,最佳装液量50mL/250mL。（2）以枯草芽孢杆菌CS27为材料,利用Plackett-Burman设计法,对影响菌体生长的8个因素进行筛选,确定影响菌体生长的主要因素为黄豆粉、氯化铵、初始pH；采用响应面分析法对这3个重要因子的最佳水平进行研究。结果表明当黄豆粉浓度为1.7%,氯化铵浓度为0.17%,初始pH6.1,菌体生物量由1.34×109cfu/ml提高到1.55×109cfu/ml,提高了20%。（3）对5L发酵罐上枯草芽孢杆菌CS27的发酵工艺进行研究,确定最佳工艺条件：搅拌速度180r/min,pH6.5,溶氧量10%,最适培养时间21h,所获得的枯草芽孢杆菌CS27菌体生物量约为1.45×1010cfu/mL。（4）探讨用吸附剂吸附液体发酵细胞的固体菌剂的保藏方法。结果表明,吸附剂的效果依次为沸石>谷壳糠>白炭黑,当菌种液：沸石1：7吸附时固体菌剂保藏效果最好,菌剂保藏三个月细胞存活率最高为70.28%。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 引言
• 1 饲用微生物添加剂研究的理论依据
• 1.1 长期使用杭生素添加剂引起畜禽内源性感染和二重感染
• 1.2 耐药菌株的产生
• 1.3 长期使用杭生素造成畜禽机体免疫力下降
• 1.4 长期使用杭生素在畜产品和环境中造成残留
• 2 微生态制剂的概念、分类及应用研究进展
• 2.1 微生态制剂的概念
• 2.2 饲用微生物添加剂的种类
• 2.2.1 按微生物菌种划分
• 2.2.2 按菌株组成划分
• 2.2.3 按作用机制划分
• 3 饲用芽孢杆菌的概述及应用研究进展
• 3.1 芽孢杆菌的概述
• 3.2 饲用芽孢杆菌菌种
• 3.3 饲用芽孢杆菌应用研究进展
• 3.3.1 饲用芽孢杆菌制剂在养猪业中的研究进展
• 3.3.2 饲用芽孢杆菌制剂在养鸡业中的研究进展
• 3.3.3 饲用芽孢杆菌制剂在反刍动物中的研究进展
• 4 饲用芽孢杆菌的作用机制
• 4.1 生物夺氧作用
• 4.2 拮抗致病微生物,改善体内外生态环境
• 4.3 增强免疫功能,促进动物的抗病能力
• 4.4 促进动物生理机能成熟
• 4.5 产生多种消化酶
• 4.6 产生多种营养物质
• 5 微生态制剂的生产工艺
• 6 动物微生态制剂存在的问题
• 7 微生态制剂的发展趋势及应用前景
• 8 本研究的目的和意义
• 第二章 枯草芽孢杆菌CS27（Bacillus subtilis）液体发酵条件优化
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.1.1 试验菌株
• 1.1.2 试验试剂
• 1.1.3 试验仪器
• 1.1.4 培养基
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 种子液的制备
• 1.2.2 发酵菌数测定
• 1.2.3 单因素试验
• 1.2.4 正交试验
• 1.2.5 发酵条件优化
• 2 结果与分析
• 2.1 培养基筛选
• 2.1.1 不同有机碳氮源对CS27细胞生物量的影响
• 2.1.2 不同无机氮源对CS27细胞生物量的影响
• 2.1.3 碳、氮源最佳浓度对CS27细胞生物量的影响
• 2.1.4 碳源、氮源正交试验
• 2.1.5 无机盐筛选与最佳浓度试验
• 2.1.6 无机盐正交试验
• 2.2 发酵条件的优化
• 2.2.1 温度对发酵菌数的影响
• 2.2.2 初始pH对发酵菌数的影响
• 2.2.3 装液量对发酵菌数的影响
• 2.2.4 接种量对发酵菌数的影响
• 2.2.5 黄豆粉目数对发酵菌数的影响
• 3 讨论
• 第三章 响应面法优化CS27菌株培养基
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.1.1 试验菌株
• 1.1.2 试验试剂
• 1.1.3 试验仪器
• 1.1.4 培养基
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 活菌计数法
• 1.2.2 种子液的制备
• 1.2.3 培养基优化方法
• 2 结果与分析
• 2.1 Plackett-Burman设计
• 2.2 响应面分析优化CS27发酵条件
• 2.2.1 Box-Behnken设计
• 2.2.2 二次回归拟合及方差分析
• 2.2.3 模型的验证
• 3 讨论
• 第四章 枯草芽孢杆菌CS27在5L发酵罐上培养条件及固体保藏条件研究
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.1.1 试验菌株
• 1.1.2 试验试剂
• 1.1.3 试验仪器
• 1.1.4 培养基
• 1.2 培养方法
• 1.3 测定方法
• 1.3.1 发酵菌数测定
• 1.3.2 固体菌剂菌数测定
• 1.4 枯草芽孢杆菌CS27发酵工艺条件
• 1.4.1 搅拌速度
• 1.4.2 最佳pH
• 1.4.3 溶氧量
• 1.4.4 培养时间
• 1.5 固体保藏
• 2 结果与分析
• 2.1 枯草芽孢杆菌CS27的发酵工艺条件
• 2.1.1 搅拌速度
• 2.1.2 最佳pH
• 2.1.3 溶氧量的确定
• 2.1.4 培养时间的确定
• 2.2 固体菌剂保藏
• 2.2.1 谷壳糠吸附对菌剂保藏期的影响
• 2.2.2 沸石吸附对菌剂保藏期的影响
• 2.2.3 白炭黑吸附对菌剂保藏期的影响
• 3 讨论
• 第五章 结论与展望
• 1 结论
• 2 展望
• 参考文献
• 致谢