论文摘要
背景和目的:肿瘤干细胞（Tumor Stem Cells, TSCs）的发现促使我们重新审视恶性肿瘤的生物学行为。肿瘤干细胞被认为是肿瘤发生、侵袭、血管生成和治疗抵抗的根源,也是未来肿瘤治疗的重要靶点。慢性炎症与恶性肿瘤发生、演进、侵袭和转移相伴而行,炎症细胞和炎症介质是肿瘤微环境的重要组成部分。慢性炎症可以诱导恶性肿瘤的发生,也能够被恶性肿瘤诱导,这种炎症微环境能进一步促进肿瘤的发展演进,在肿瘤各种恶性生物学行为的调控中发挥着重要作用。新近研究表明,炎症介质CXCL8及其受体CXCR1促进乳腺癌干细胞“干性”的维持;Foxp3+IL-17+T细胞能够促进结肠癌干细胞的增殖;胶质瘤干细胞（Glioma stem cells, GSCs）能够抑制T细胞的激活和增殖。因此,炎症介质和炎症细胞与肿瘤干细胞之间存在交互作用,两者共同影响了恶性肿瘤的生物学行为。深入探讨肿瘤干细胞和肿瘤炎症之间的交互作用可能为以肿瘤干细胞为靶点的治疗策略提供新的思路和实验依据。GSCs已在恶性胶质瘤中得到证实,其与胶质瘤相关炎症之间的关系有待进一步明确。由于胶质瘤生长部位的特殊性,胶质瘤相关炎症与其他肿瘤相关炎症之间存在较大差别。小胶质细胞/巨噬细胞是恶性胶质瘤中最主要的免疫浸润细胞。由于目前还没有一个标志物能够区分人恶性胶质瘤中的小胶质细胞和巨噬细胞,因此,两者常被视为一个整体进行研究,即胶质瘤相关小胶质细胞/巨噬细胞（Glioma associated microglia/macrophages, GAM/Ms）。相关研究显示,GAM/Ms广泛分布于恶性胶质瘤内和瘤周组织,其数量超过胶质瘤中其他各类免疫细胞数量的总和。多种肿瘤衍生因子诱导了GAM/Ms的浸润趋化。GAM/Ms在胶质瘤中均表现出免疫抑制表型,同时其能够促进肿瘤细胞的增殖、侵袭和免疫逃逸,促进肿瘤血管生成。GAM/Ms的浸润趋化及其表现出的免疫抑制表型与GSCs之间是否存在关联?GSCs与GAM/Ms之间是否存在交互作用并进一步促进恶性胶质瘤的生长演进?这些问题都有待进一步解答。GSCs是胶质瘤发生复发的根源,细胞微环境是其存活和“干性”维持的基本要素,但GSCs微环境的构建模式尚不清楚。有学者提出并证实,GSCs微环境是围绕微血管构建的细胞微环境,微血管及其内皮细胞提供了GSCs存活和“干性”维持所需的细胞因子和激活信号。如前所述,越来越多的研究提示,炎症因子和炎症细胞也能够促进肿瘤干细胞的“干性”维持和侵袭。那么,炎症微环境是否也是GSCs微环境的主要构成因素之一?炎症在病理学上被定义为以血管事件为中心事件的病理过程。因此,结合已被证实的GSCs微血管环境,我们有必要深入探讨GSCs与GAM/Ms之间的交互作用,研究结果可能为进一步阐述GSCs微环境构筑特点奠定基础。材料和方法1、运用条件培养基压力筛选的方法从小鼠恶性胶质细胞瘤细胞系GL261中分离培养出干细胞样克隆球（GL261 neurosphere,GL261-NS）。2、免疫荧光染色和流式细胞检测测定GL261-NS中干细胞标志物及其分化培养后贴壁细胞（GL261 adhesive cells,GL261-AC）多向分化标志物的表达情况。3、有限稀释实验和单克隆形成实验检测GL261-NS和GL261-AC的自我更新能力。4、利用小鼠脑立体定位仪将GL261-NS接种至C57BL/6尾状核建立同源性GSCs颅内移植瘤模型。5、利用免疫组化染色检测人原代恶性胶质瘤、SCID小鼠GSCs颅内移植瘤和同源性GSCs颅内移植瘤中免疫细胞浸润的情况。6、利用免疫组化观察32例人各病理级别星形胶质细胞瘤中GSCs细胞密度和GAM/Ms浸润数量的关系,分析人恶性胶质瘤中GSCs和GAM/Ms的分布规律。7、运用条件培养基压力筛选的方法从人恶性胶质母细胞瘤中分离培养人原代GSCs及其诱导分化后获得的贴壁胶质瘤细胞（Adhesive glioma cells, AGCs）。8、利用Realtime-PCR检测人原代GSCs和AGCs中多种诱导巨噬细胞迁移趋化细胞因子的转录水平。9、利用Transwell小室和抗体阻断实验观察GSCs和AGCs对人原代小胶质细胞趋化迁移能力的影响。10、利用抗体阻断实验和单克隆形成实验检测了Neurotensin （NTS）对GSCs自我更新能力的影响。11、利用同源性GSCs颅内移植瘤模型观察GSCs对GAM/Ms趋化浸润的影响。12、利用ELISA检测了GL261-NS和GL261-AC中VEGF-A、M-CSF和TGF-β1的表达水平。13、利用Western-blot和流式细胞仪检测经GL261-NS和GL261-AC处理的小胶质细胞BV2中p-STAT3的表达水平。14、利用Transwell共培养模型和CCK8细胞增殖检测试剂盒检测经GL261-NS和GL261-AC处理的小胶质细胞对T细胞增殖的抑制效应。15、利用荧光颗粒吞噬实验观察GL261-NS和GL261-AC对小鼠小胶质细胞BV2吞噬能力的影响。主要结果:1、胶质瘤细胞系GL261中GSCs的分离鉴定（1）利用培养基中血清递减和条件培养基压力筛选的方法能够从小鼠胶质瘤细胞系GL261中获得干细胞样神经球,即GL261-NS。GSCs在GL261-NS中富集,表达干细胞标志物CD133、Nestin和Olig2。（2） GL261-NS在含有血清的培养基中贴壁分化,成为分化胶质瘤细胞,即GL261-AC。GL261-AC分别有部分细胞表达分化标志物GFAP、MAP2和MBP。（3） GL261-NS的自我更新能力较GL261-AC明显增强。57.31%±8.53%的GL261-NS单细胞具有自我更新能力,而仅有2.62%±0.23%的GL261-AC单细胞具有自我更新能力。（4）梯度细胞密度成瘤实验和原位移植瘤荷瘤小鼠生存分析都表明,GL261-NS的成瘤能力较GL261-AC更强,GL261-NS荷瘤小鼠的生存期较GL261-AC荷瘤小鼠明显缩短。2、同基因GSCs颅内移植瘤模型的建立与常用的SCID小鼠GSCs颅内移植瘤相比,同源性GSCs颅内移植瘤模型能够更好的模拟人原代恶性胶质瘤的免疫微环境,对GSCs体内生物学特性的评估可能更准确。3、GSCs在GAM/Ms趋化浸润中发挥主导作用（1）人星形胶质细胞瘤中,肿瘤的病理级别、GSCs细胞数量和GAM/Ms浸润程度呈正相关关系。（2）恶性胶质瘤中,GSCs和GAM/Ms的分布区域具有一致性,两者分布最密集的区域均为微血管周围和胶质瘤边缘。GSCs细胞密度越高的区域,GAM/Ms浸润越明显。（3） Real-time PCR结果显示,与AGCs相比,GSCs中CCL2, CCL5和CCL7的mRNA转录水平上调2-3倍,VEGF-A的mRNA转录水平在GSCs中上调7倍,NTS的mRNA转录水平在GSCs中上调约50倍。（4）人原代GSCs体外诱导原代小胶质细胞迁移趋化的能力强于AGCs。在此过程中,人原代GSCs上调表达的CCL5、VEGF-A和NTS可能发挥重要作用。（5）阻断NTS能够使GSCs的自我更新能力降低,提示NTS可能以自分泌的方式促进GSCs的自我更新。（6）同源性GSCs颅内移植瘤模型证实,GL261-NS生成的肿瘤中GAM/Ms浸润程度明显高于GL261-AC生成的肿瘤。4、GSCs诱导GAM/Ms的免疫抑制表型（1） GL261-NS表达多种能够拿诱导GAM/Ms免疫抑制表型的细胞因子。与GL261-AC相比,GL261-NS分泌VEGF和M-CSF的能力更强,GL261-NS可能具有更强的免疫抑制微环境的诱导能力,从而帮助其实现免疫逃逸。（2）经GL261-NS和GL261-AC处理的小胶质细胞BV2中,p-STAT3表达水平以及p-STAT3表达阳性细胞的比例均较空白对照组BV2细胞明显上调,其中GL261-NS处理组上调幅度更加明显。（3） GL261-NS和GL261-AC均能够抑制小胶质细胞BV2诱导的T细胞增殖效应,但GL261-NS的抑制能力与GL261-AC之间没有显著性差异。（4） GL261-NS和GL261-AC均能够有效抑制小胶质细胞BV2的吞噬能力。与GL261-AC相比,GL261-NS抑制小胶质细胞吞噬能力的效应更加明显。结论:1、GSCs在GL261-NS中富集,GL261-NS能够自我更新和多向分化,并且具有比GL261-AC更强的成瘤能力。2、利用GL261-NS和C57BL/6小鼠建立的同源性GSCs颅内移植瘤模型能够更好的复制胶质瘤的炎症微环境,为更准确的评估GSCs恶性生物学行为提供了可靠的在体研究模型。3、GSCs在诱导GAM/Ms迁移浸润中发挥主要作用。GSCs产生的Neurotensin不仅能够诱导GAM/Ms浸润,还能够促进GSCs的自我更新。4、GSCs能够调控小胶质细胞的免疫抑制表型。GSCs在诱导GAM/Ms趋化浸润中发挥的主导作用及其对GAM/Ms免疫抑制表型的调控作用可能是GSCs炎症微环境构建的基础。
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