光暗条件下拟南芥CESA2和CESA5对CESA6功能冗余的研究

论文摘要

拟南芥是重要模式植物,已发现10个纤维素合酶基因（AtCesA1～AtCesA10）。AtCESA1、AtCESA3、AtCESA6是初生壁纤维素合酶基因,AtCESA4、AtCESA7、AtCESA8是次生壁纤维素合酶基因,分别参与拟南芥不同生育期的纤维素合成；根据突变体的表型变化推测AtCESA2、AtCESA5、AtCESA9对AtCESA6可能存在部分功能冗余。但AtCESA2、AtCESA5对AtCESA6的冗余过程,AtCESA2、AtCESA5在纤维素合成中的作用等问题还不清楚。本实验根据拟南芥8个纤维素合酶基因（AtCesA1～AtCesA8）序列,在高变区Ⅰ处设计引物,合成了GST-AtCESAs融合蛋白,制备了抗体。以AtCesA6突变体为材料（prc1-1、cesa6）,从基因水平、蛋白水平和细胞壁成分三方面研究了在光暗条件下AtCESA2和AtCESA5对AtCESA6的冗余功能,探讨AtCESA2、AtCES-A5在纤维素合成中的作用。主要结果如下：1.纤维素合酶抗体的制备和检测制备了AtCESA1～AtCESA8的多克隆抗体。Western-blotting检测发现：AtCESA4和AtCESA7有严重的交叉反应,所以这两个抗体不能使用；其它抗体都能在拟南芥原生质膜上免疫出相应的特异条带。2.光暗处理下拟南芥下胚轴AtCesAs的表达分析GUS染色结果和Real-time PCR结果表明：AtCesA1、AtCesA3、AtCesA6暗处理下表达明显增加；AtCesA2暗处理下表达量较低,而暗转光后表达量明显增加；AtCesA5光暗处理下表达变化趋势不显著。3.光暗处理下拟南芥突变体纤维素合酶基因水平分析与野生型相比,突变体prc1-1、cesa6光暗处理下的AtCesAs的表达都显著降低；光暗比较发现：暗处理下prc1-1、cesa6的AtCesA1、AtCesA3、AtCesA5的表达明显高于光处理。4.光暗处理下拟南芥突变体纤维素合酶蛋白水平分析与野生型相比,光暗处理下prc1-1、cesa6原生质膜总蛋白中的AtCESA6显著降低,AtCESA5显著增加。光下AtCESA2在AtCESAs中所占的比例并没有明显的变化,而暗处理下AtCESA2在AtCESAs中所占比例显著降低。因此推测,AtCESA5在光暗9天的prc1-1、cesa6中都能替补AtCESA6的部分功能,维持突变体存活；AtCESA2只在光下9天的prc1-1、cesa6中弥补AtCESA6的部分功能,使植株能够正常生长。但是在突变体纤维素合酶复合体中AtCESA1、AtCESA3、AtCESA6、AtCESA2、AtCESA5的含量都降低了。与野生型相比,光下突变体prc1-1、cesa6的纤维素合成量显著增加,胼胝质合成量没有明显变化,cesa6的更为显著；而暗处理下纤维素、胼胝质合成量显著降低,prc1-1的更为明显。5.拟南芥突变体成分分析与野生型相比,光下9天,prc1-1的晶体纤维素显著下降,非晶体纤维素显著增加；cesa6的晶体纤维素含量降低了,非晶体纤维素、半纤维素、果胶质、可溶性糖都显著增加。暗处理9天,prc1-1的晶体纤维素显著下降,非晶体纤维素、半纤维素、果胶质、可溶性糖都显著增加；cesa6的晶体纤维素显著下降,非晶体纤维素没有明显变化,而半纤维素、果胶质、可溶性糖都显著增加。6. AtCesA6突变后对次生壁的影响与野生型相比,prc1-1、cesa6秸秆的果胶质显著增加,半纤维素、非晶体纤维素和晶体纤维素都显著降低,木质素变化不显著。prc1-1、cesa6秸秆纤维素的聚合度、结晶度没有明显的变化；半纤维素的支链有明显的增多；木质素单体的H显著增加,G、S显著降低。与野生型相比,cesa6的纤维素酶酶解产糖率最高增加（8.83±0.87）%,prcl-1增加（5.68±0.49）%；而IRX-3的增加了（36.63±2.67）%。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 1 文献综述
• 1.1 植物细胞壁的研究进展
• 1.1.1 植物细胞壁的结构
• 1.1.2 植物细胞壁的化学组成
• 1.1.3 植物细胞壁的作用
• 1.2 植物纤维素的研究进展
• 1.2.1 植物纤维素的理化性质
• 1.2.2 植物纤维素的作用
• 1.2.3 植物纤维素的生物合成
• 1.3 植物纤维素合酶的研究进展
• 1.3.1 植物纤维素合酶的发现
• 1.3.2 植物纤维素合酶基因结构特点
• 1.3.3 植物纤维素合酶蛋白结构特点
• 1.3.4 植物纤维素合酶的表达与调控
• 1.4 本研究的目的与意义
• 2 实验材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 载体与宿主菌
• 2.1.2 植物材料
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 仪器设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 拟南芥的种植
• 2.2.1.1 营养土种植
• 2.2.1.2 1/2MS固体培养基种植
• 2.2.1.3 1/2MS液体培养基种植
• 2.2.2 拟南芥纤维素合酶抗体制备
• 2.2.2.1 抗原表位分析
• 2.2.2.2 引物设计
• 2.2.2.3 拟南芥叶片总RNA的提取
• 2.2.2.4 第一链cDNA的合成
• 2.2.2.5 PCR反应
• 2.2.2.6 PCR产物的胶回收
• 2.2.2.7 目的片段与pGEX-4T-3的连接
• 2.2.2.8 重组质粒（pGEX-AtCesAs）的转化
• 2.2.2.9 目的片段的测序
• 2.2.2.10 融合蛋白诱导表达
• 2.2.2.11 融合蛋白表达和溶解性检测
• 2.2.2.12 融合蛋白的纯化
• 2.2.2.13 抗体制备
• 2.2.2.14 抗体纯化
• 2.2.2.15 融合蛋白的凝血酶切割
• 2.2.2.16 拟南芥原生质膜提取
• 2.2.2.17 Western-blotting分析
• 2.2.3 拟南芥野生型光暗处理
• 2.2.3.1 拟南芥光暗处理过程
• 2.2.3.2 GUS染色
• 2.2.3.3 光暗处理拟南芥下胚轴长度的变化
• 2.2.3.4 Real-time引物扩增效率（E）的确定
• 2.2.3.5 拟南芥AtCesAs的基因表达变化
• 2.2.3.6 基因表达差异的分析方法
• 2.2.4 cesa6转录通读鉴定
• 2.2.4.1 突变体总DNA提取
• 2.2.4.2 突变体总RNA提取
• 2.2.4.3 突变体总RNA的反转录
• 2.2.4.4 PCR反应
• 2.2.4.5 PCR产物的胶回收
• 2.2.4.6 AT克隆
• 2.2.5 拟南芥突变体的表型观察
• 2.2.5.1 光下，突变体表型观察
• 2.2.5.2 光暗处理下，突变体表型观察及电镜分析
• 2.2.6 拟南芥突变体纤维素合酶基因水平分析
• 2.2.6.1 光暗9天，突变体全植株AtCesAs的基因表达变化
• 2.2.6.2 光下，突变体茎秆AtCesAs的基因表达变化
• 2.2.7 光暗处理下拟南芥突变体纤维素合酶蛋白水平分析
• 2.2.7.1 光暗9天，突变体全植株的纤维素合酶复合体蛋白分析
• 2.2.7.2 光暗9天，突变体纤维素合酶复合体活性分析
• 2.2.8 拟南芥突变体成分分析
• 2.2.8.1 细胞壁成分的提取方法
• 2.2.8.2 GCMS测定单糖组成
• 2.2.8.3 细胞壁成分测定标准曲线的制备
• 2.2.9 拟南芥突变体秸秆木质素含量测定
• 2.2.10 拟南芥突变体秸秆的降解转化
• 2.2.11 HPLC测定突变体木质素单体组成
• 2.2.12 突变体秸秆纤维素聚合度测定
• 2.2.13 突变体秸秆纤维素结晶度测定
• 3 结果与分析
• 3.1 拟南芥纤维素合酶抗体制备
• 3.1.1 AtCESAs抗原表位预测
• 3.1.2 表达载体的构建
• 3.1.3 融合蛋白表达和溶解性检测
• 3.1.4 融合蛋白的纯化
• 3.1.5 多克隆抗体IgG纯化
• 3.1.6 GST-AtCESAs抗体交叉反应检测
• 3.1.7 GST-AtCESAs抗体特异性检测
• 3.2 拟南芥野生型光暗处理
• 3.2.1 GUS染色
• 3.2.2 光暗处理拟南芥下胚轴长度的变化
• 3.2.3 Real-time引物扩增效率（E）的确定
• 3.2.4 拟南芥AtCesAs的表达变化
• 3.2.4.1 光暗处理拟南芥下胚轴的表达变化
• 3.2.4.2 拟南芥不同组织的表达变化
• 3.3 cesa6转录通读鉴定
• 3.3.1 cesa6突变体纯合确定
• 3.3.2 cesa6突变体3'-cDNA转录鉴定
• 3.3.3 cesa6转录通读的鉴定
• 3.3.4 cesa6转录通读后T-DNA的变化
• 3.4 拟南芥突变体表型观察
• 3.4.1 光下，AtCesA6突变体表型观察
• 3.4.2 光暗处理下，AtCesA6突变体表型观察及电镜分析
• 3.4.3 光下，突变体表型观察
• 3.4.4 光下，突变体茎秆的电镜切片
• 3.5 拟南芥突变体纤维素合酶基因表达变化
• 3.5.1 光暗9天，突变体全植株AtCesAs的表达变化
• 3.5.2 光下，突变体茎秆AtCesAs的表达变化
• 3.6 光暗处理下拟南芥突变体纤维素合酶蛋白水平分析
• 3.6.1 光暗9天，突变体全植株AtCESAs的表达变化
• 3.6.2 光暗9天，突变体纤维素合酶活性分析
• 3.7 拟南芥突变体成分分析
• 3.7.1 光暗9天，AtCesA6突变体全植株成分分析
• 3.7.2 突变体秸秆成分分析
• 3.7.3 突变体半纤维素单糖组成分析
• 3.7.4 突变体果胶质单体组成分析
• 3.8 突变体秸秆木质素单体组成分析
• 3.9 突变体秸秆纤维素结构特性分析
• 3.10 突变体秸秆的降解转化
• 4 讨论
• 4.1 抗体的制备
• 4.2 拟南芥的光暗处理
• 4.3 转录通读现象
• 4.4 突变体表型
• 4.5 AtCESA2、AtCESA5对AtCESA6的功能冗余作用
• 4.6 AtCesA6突变后对次生壁的影响
• 4.7 总结与展望
• 参考文献
• 附录
• 致谢