论文摘要
第一部分兔骨髓间充质干细胞的分离与培养目的：优化获取兔骨髓间充质干细胞并对其进行纯化、鉴定，同时对其生物学性状进行研究，为下一步的研究打下基础。方法：取新生新西兰大耳白兔骨髓5.0ml，采用密度梯度离心法、贴壁筛选法并结合传代对其进行纯化，观察细胞形态、超微结构和表面标志物的表达等，从而对其进行鉴定。观察第1代、第3代、第5代、第8代和第10代细胞的增殖情况，并绘制出生长曲线。结果：经密度梯度离心法、贴壁筛选法并结合传代方法所得的间充质干细胞很纯，第3代和第5代细胞形态单一，细胞排列具有典型的漩涡状结构。第1代、第3代、第5代细胞增殖能力强，细胞生长旺盛，而第8代、第10代细胞增殖明显减弱。所分离培养的细胞表达CD44、CD90，不表达CD34，电镜观察为低分化细胞。结论：分离培养的细胞为间充质干细胞且成分单一，具有干细胞特性，第3代、第5代细胞很纯且其增殖能力强，适用于做以后的研究。第二部分富血小板血浆对间充质干细胞的增殖作用目的：体外培养间充质干细胞并探讨富血小板血浆（platelet-rich plasma，PRP）对其分裂增殖的影响，以期找到一种较为理想的扩增间充质干细胞的方法，为以后的研究打下基础。方法：采用Appel方法提取PRP，并用其对间充质干细胞进行培养（设立三个浓度梯度即PRP-A组、PRP-B组、PRP-C组和空白对照组），每日对细胞进行计数并绘制细胞生长曲线，用MTT比色法分析各组MSC的存活和增殖能力。结果：含有PRP的PRP-A组、PRP-B组、PRP-C组均保持较高的增殖活性，呈快速生长，曲线上升幅度大，与空白对照组比较差异有显著意义或极显著意义（P＜0.05或P＜0.01）。最高剂量的PRP-A组作用最为明显。结论：PRP能明显促进MSC增殖，PRP对MSC的促进增殖能力具有剂量依赖性。第三部分间充质干细胞向雪旺样细胞分化及其对神经生长因子分泌功能的检测目的：研究间充质干细胞在体外向雪旺样细胞分化的可行性并对细胞的分泌功能进行检测。方法：取第3代生长状态良好的间充质干细胞，联合诱导组通过β-巯基乙醇（第1d）和维甲酸（第2-4d）序贯诱导后用含PRP的完全培养基培养7d，用荧光染色法对S-100进行鉴定，并于培养的第4d、第7d、第9d和第11d在细胞换液前收集培养液，用酶联免疫吸附试验（ELISA法）检测NGF的含量，于培养的第11d收集细胞进行RT-PCR试验以检测NGF mRNA的表达，并和单纯诱导组（通过β-巯基乙醇和维甲酸序贯诱导后用不含PRP的完全培养基培养）和空白对照组（不进行诱导，培养方法和MSC的培养方法）比较。结果：体外经诱导间充质干细胞发生形态上的改变并表达S-100蛋白，联合诱导组和单纯诱导组细胞的培养液中均能检测到含量较高的NGF，第4d时与对照组比较差异有极显著意义（P＜0.01，P＜0.01）。NGF的含量在第7d、第9d、第11d天联合诱导组明显高于单纯诱导组，差异有显著意义（P＜0.05）。联合诱导组和单纯诱导组均表达NGF mRNA，联合诱导组表达强度更加明显，差异有显著意义（P＜0.05）。结论：间充质干细胞体外能诱导分化为雪旺样细胞，且具有分泌NGF的功能，经诱导后用PRP处理能明显提高诱导的效率。第四部分兔间充质干细胞联合自体富血小板血浆对周围神经再生作用的实验研究目的：通过再生室中注入MSC细胞悬液和／或靶肌肉注射自体PRP，观察其在周围神经再生中的作用，以期找到一种促进周围神经再生的好方法。方法：32只新西兰大耳白兔，随机分成4组，即NGF组、PRP组、MSC组和联合组。横断左侧坐骨神经后行神经外膜直接缝合（NGF组和PRP组）或行硅胶管套接形成再生室（MSC组和联合组），再生室中注入MSC细胞悬液（MSC组和联合组）和／或靶肌肉注射自体PRP（PRP组），并和靶肌肉注射NGF（NGF组）作比较，检测指标包括形态学观察、靶肌肉肌湿重恢复率、运动神经传导速度（MNCV）及轴突直径和髓鞘厚度等。结果：形态学观察PRP组和MSC组均优于NGF组，联合组优于MSC组和PRP组。靶肌肉肌湿重恢复率、MNCV、轴突直径和髓鞘厚度和形态学观察的基本一致。结论：靶肌肉注射PRP或再生室的微环境中应用MSC均能促进周围神经再生，其作用优于NGF，两者联用效果更佳。
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