肝素黄杆菌肝素酶基因在大肠杆菌中表达的研究

论文摘要

肝素酶（heparanase, Hpa）是近年来研究较多的一类-D糖苷内切酶（endo-D-glucuronidase）,它既存在于正常组织,如胎盘和淋巴器官,对胚胎的形成,神经系统的发育,新生血管的形成,炎症反应等都发挥着正常的生理功能；同时也表达于多种恶性肿瘤细胞的表面,能够促进细胞的侵袭和转移,诱导肿瘤血管生成,降低肿瘤患者的生存率。肝素用于治疗和预防血栓已经有很长的历史,但是研究表明肝素有一定的副作用,例如影响血小板的稳定,从而导致手术后大出血。而分子量在4000-8000的低分子量肝素（LMWH）则能够有效地治疗血栓,但是没有明显的副作用。目前我国LMWH主要依靠进口或者来自合资企业生产,因此LMWH的生产研究具有重要的工业应用前景。而肝素酶的重要用途之一便是用于生产LMWH。针对以上问题,本课题组构建了高效表达可溶性肝素酶的重组大肠杆菌系统,获得了纯度高,活力高,性质稳定的肝素酶,极大降低了肝素酶的生产成本,使得肝素酶用于LMWH的生产成为可能。本课题组已完成了以大肠杆菌表达系统克隆表达黄杆菌肝素酶基因的工作,并以该基因作为起始材料,利用酶活测定方法筛选出高活力菌株；然后对其发酵培养基进行优化；最后对重组蛋白进行表达、纯化并研究其酶学性质。主要研究结果如下所述：提取黄杆菌肝素酶的全基因组,设计合适的引物（引入HindⅢ和EcoR Ⅰ两个酶切位点）,利用PCR技术扩增出肝素酶的ORF;同时用上述两种酶双酶切pET-28a载体和肝素酶基因,在T4连接酶的作用下连接上述目的基因与载体片段。将所得到的克隆载体转化大肠杆菌BL21菌株,在含Kan的固体LB培养基上筛选阳性可克隆子。经PCR、酶切鉴定成功后测序确定重组表达载体构建成功。以适当浓度的IPTG诱导表达肝素酶,用SDS-PAGE检测不同的诱导时间下肝素酶的表达量,从而确定最佳的诱导时间。结合酶活测定方法,得到表达肝素酶最高活性的菌株。采用两水平部分因子实验设计研究了发酵培养基各组分对肝素酶活力的影响,得出主要影响因子为蛋白胨、酵母粉和葡萄糖。三者在95%的概率水平上对菌体产酶都有正效应。然后采用BBD确定各主要影响因子的最佳作用浓度,得到优化的发酵培养基组成（g/L）：蛋白胨11.95,酵母粉7.4,葡萄糖2.74,Na2HPO4·12H2O10, MgSO4·7H2O0.5, NH4Cl3, KH2P042。在优化发酵培养基中供试菌株的酶活力是未优化发酵培养基中的1.95倍。发酵液经镍柱亲和层析纯化得到电泳纯肝素酶,SDS-PAGE电泳结果显示,经纯化得到一条单一的目的蛋白条带,经分析得该酶的分子量为42.9kDa。对纯化后肝素酶的酶学性质进行研究,发现该酶的最适反应温度为30℃,最适反应pH为7.0。该酶热稳定性较差,当温度高于60℃时,30min可完全丧失酶活。当pH范围在7-10之间时,1h内酶活基本不受影响,偏离此范围则对酶活影响较大。对比8种不同金属离子对优化后酶的活性影响,发现Ca2+和Cu2+对该酶有比较明显的激活作用,Mn2+和Pb2+对该酶有明显的抑制作用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 引言
• 1.1 研究背景
• 1.2 研究进展
• 1.2.1 肝素酶的来源
• 1.2.2 肝素酶的作用机理
• 1.2.3 肝素酶的表达研究
• 1.2.4 肝素酶的分离纯化
• 1.2.5 肝素酶的酶学性质
• 1.2.6 响应面法优化肝素酶发酵培养基
• 1.2.7 肝素酶的应用
• 1.2.7.1 肝素酶在制备低分子量肝素（LMWH）中的应用
• 1.2.7.2 体外循环中消除肝素
• 1.2.7.3 研究肝素的精确结构和低聚寡糖活性筛选
• 1.2.7.4 药用研究
• 1.3 研究目的和意义
• 1.4 研究内容
• 1.4.1 肝素酶重组表达载体的构建
• 1.4.2 肝素酶基因在大肠杆菌中的表达研究
• 1.4.3 重组肝素酶发酵培养基成分的优化
• 1.4.4 肝素酶的分离纯化
• 1.4.5 重组肝素酶酶学性质的研究
• 1.5 技术路线
• 第2章 肝素酶原核表达载体pET-28a-Hpa Ⅰ的构建
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株和质粒
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 试剂
• 2.1.3.1 质粒提取试剂
• 2.1.3.2 其它试剂
• 2.1.3.3 试剂盒
• 2.1.3.4 限制性内切酶及工具酶
• 2.1.3.5 核酸分子量标准
• 2.1.4 仪器设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 肝素黄杆菌基因组DNA的提取
• 2.2.2 pET-28a质粒的提取
• 2.2.3 肝素黄杆菌肝素酶Hpa Ⅰ基因的扩增
• 2.2.3.1 引物的设计
• 2.2.3.2 PCR扩增体系参数
• 2.2.3.3 PCR扩增程序
• 2.2.3.4 PCR产物的纯化回收
• 2.2.4 重组质粒pET-28a-Hpa Ⅰ基因的构建
• 2.2.4.1 PCR产物的双酶切
• 2.2.4.2 pET-28a载体双酶切
• 2.2.4.3 双酶切产物的回收
• 2.2.4.4 用T4 DNA连接酶将载体pET-28a和Hpa Ⅰ进行连接
• 2.2.4.5 感受态细胞的制备
• 2.2.4.6 连接产物的转化
• 2.2.5 重组转化质粒的鉴定
• 2.2.5.1 重组质粒的提取
• 2.2.5.2 原核表达载体pET-28a-Hpa Ⅰ的鉴定
• 2.3 结果分析
• 2.3.1 Hpa Ⅰ基因的获取
• 2.3.2 pET-28a载体和Hpa Ⅰ基因双酶切
• 2.3.3 pET-28a-Hpa Ⅰ重组质粒的构建
• 2.3.4 重组质粒pET-28a-Hpa Ⅰ的PCR鉴定
• 2.3.5 重组质粒pET-28a-Hpa Ⅰ的双酶切鉴定
• 2.3.6 测序结果及分析
• 2.4 本章小结
• 第3章 黄杆菌肝素酶基因在大肠杆菌中的表达研究
• 3.1 材料
• 3.1.1 菌株
• 3.1.2 试剂
• 3.1.2.1 培养基
• 3.1.2.2 其它试剂
• 3.1.3 仪器设备
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 重组质粒BL21-pET-28a-Hpa Ⅰ的诱导表达
• 3.2.2 肝素酶活性的测定
• 3.2.2.1 肝素酶活标准曲线的建立
• 3.2.2.2 肝素酶活性测定方法
• 3.2.3 表达产物的SDS-PAGE分析
• 3.2.3.1 SDS-PAGE电泳使用溶液
• 3.2.3.2 SDS聚丙烯酰胺凝胶的制备
• 3.2.3.3 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 表达产物的SDS-PAGE
• 3.4 本章小结
• 第4章 培养基成分的优化
• 4.1 材料
• 4.1.1 实验菌株
• 4.1.2 培养基
• 4.1.3 试剂
• 4.1.4 主要仪器设备
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 部分因子实验设计
• 4.2.2 Box-Behnken实验设计
• 4.2.3 测定方法
• 4.2.3.1 粗酶液的制备
• 4.2.3.2 酶活的测定
• 4.2.3.3 蛋白质的定量
• 4.3 实验结果
• 4.3.0 蛋白标准曲线的制作
• 4.3.1 部分因子实验设计
• 4.3.2 Box-Behnken实验设计
• 4.4 本章小结
• 第5章 肝素酶的纯化及酶学性质研究
• 5.1 材料
• 5.1.1 实验菌株
• 5.1.2 培养基
• 5.1.3 试剂
• 5.1.3.1 亲和纯化试剂
• 5.1.3.2 其他试剂
• 5.1.3.3 试剂盒
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 重组蛋白的大量表达与样品制备
• 5.2.2 Ni-NTA柱纯化融合蛋白
• 5.2.3 Ni-NTA柱的再生
• 5.2.4 分子量测定
• 5.2.5 温度肝素酶活性的影响及其热稳定性研究
• 5.2.6 pH对肝素酶活性的影响及其酸碱稳定性研究
• 5.2.7 金属离子种类与强度对几丁质酶活性的影响
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 His融合蛋白的纯化及分子量测定
• 5.3.2 温度对肝素酶活性的影响及其热稳定性研究
• 5.3.3 pH对酶活性的影响及其酸碱稳定性研究
• 5.3.4 金属离子种类对肝素酶活性的影响
• 5.4 本章小结
• 第6章 结论
• 6.1 结论
• 6.2 进一步研究的内容和建议
• 6.3 研究展望
• 6.3.1 不稳定性
• 6.3.2 表达体系
• 6.3.3 融合表达
• 6.3.4 糖基化
• 参考文献
• 研究生期间发表的论文
• 致谢