胰高血糖素样肽-1及其类似物基因治疗糖尿病的研究

论文摘要

报告基因是在动物模型中普遍使用的、一种可以标示目的基因转录活性的基因,包括荧光素酶、GFP等。但是,像荧光素酶那样虽然具有高灵敏度、但检测时必须裂解动物细胞或器官的报告基因,不适用于动物实验。因此,我们需要一个既可以方便检测、又无内源性表达的报告基因系统服务于将要开展的基因治疗研究。分泌性碱性磷酸酶SEAP不仅能够满足这个需要,且能在不破坏细胞的条件下对样品进行重复的检测。对实验动物而言,只用少量血液即可频繁、方便地进行目的基因的检测,对动物损伤极小但是目前普遍使用的用酶标仪检测SEAP吸光值的测试方法很难在两个样品之间比较目的基因表达效率差异,因此,亟需建立一个准确的定量方法去衡量SEAP的表达量。我们建立了一个使SEAP的吸光值与其表达真实值相对应的模型,并研究出了提高SEAP检测系统灵敏度的方法,使SEAP作为一个可量化的报告基因系统,用于细胞、组织或转基因动物实验中,更加准确地比较不同目的基因和同一目的基因之间的表达差异,为基因治疗研究实验提供了支持。方法：通过建立SEAP底物的标准曲线,做出将SEAP的吸光值与酶活力、蛋白质绝对值之间相互换算的公式,从酶动力常数、酶反应时间、不同量mRNA与酶吸光值之间对应关系等几个方面做了验证。结果：建立了在405nm波长处,SEAP的吸光值与酶活力之间相互换算的公式：y（酶活力）=0.1913*x（吸光值）-0.0028；酶活力和蛋白质绝对值之间相互换算的公式：1U（酶活力）=5.035g（蛋白质绝对量）。在细胞实验中做出了验证,并能够应用于小鼠活体实验中,并提出了提高SEAP检测系统灵敏度的方法,成功的进行了导入目的基因的不同方法的效率之间的比较,灵敏度达到10-5ng/ml。结论：使SEAP作为一个可量化的报告基因系统,从定性水平上升到定量水平,可用于细胞、组织或转基因动物实验中,为今后的实验提供支持。第二部分胰高血糖素样肽-1及其类似物对糖尿病基因治疗的研究上个世纪八十年代以来,全球范围内的糖尿病患病人数开始呈显著增长趋势。截止至2011年,最新发表在《新英格兰医学》上的“中国糖尿病大规模流行病学”研究显示,中国糖尿病患病率已达9.7%,糖尿病患病总人数已经达到9240万,位居世界前列；糖尿病前期的人数已近1.5亿,比例达15.5%。糖尿病的防治刻不容缓。胰高血糖素样肽-1（glucagons-like peptide-1, GLP-1）作为胰高血糖素基因编码的一种胃肠激素,其最显著的功能是通过促进胰岛β细胞的功能再生和防止其凋亡,以明显改善糖尿病人的血糖水平。这对Ⅰ型和Ⅱ型糖尿病的治疗都具有重要意义。然而,天然的GLP-1在体内会很快被DPP-IV （dipeptidyl protease IV, DPP-IV）降解。Eng等[4]于1992年从美国西南部的希拉毒蜥（Heloderma suspectum）唾液中分离到了短肽Exendin-4并发现它与GLP-1具有完全相同的功能,且对DPP-IV具有很高的耐受性。现在对于糖尿病的基因治疗一般以抗DPP-IV降解的GLP-1突变基因和类似物exendin-4为基础,通过载体介导,旨在体内达到持续高效的表达和延长半寿期的双重疗效。我们以STZ诱导的Ⅰ型糖尿病小鼠和高脂高糖高胆固醇饮食喂养的Ⅱ型糖尿病小鼠为模型,以电击法导入构建的GLP-1及其长效类似物exendin-4的载体来进行基因治疗的研究,意在探索一种更为有效的糖尿病基因治疗的方式和方法,为其最终能够应用于临床提供了支持。方法：1.GLP-1及其类似物在体外模型中的治疗研究构建了GLP-1-pSEAP、exendin-4-pSEAP及exendin-4-alb-pSEAP表达载体。选择用浓度45μg/ml的PA、诱导9天的条件来建立小鼠成肌细胞C2C12的胰岛素抵抗模型,研究了GLP-1及其类似物的表达载体对此模型的作用,并从细胞存活率、葡萄糖消耗量、细胞油脂含量等方面做了验证。2.GLP-1及其类似物在体内模型中的治疗研究：1)Ⅰ型糖尿病模型的治疗研究：选用150mg/kg STZ一次注射诱导的方式构建Ⅰ型糖尿病小鼠模型,先后对模型小鼠以注射30μgDNA、60V电击1次的方法导入exendin-4基因,进行了两次治疗研究,用Real-time PCR法验证了目的基因在小鼠体内的表达,并从空腹血糖、随机血糖、口服葡萄糖耐量试验、血清甘油三酯、空腹胰岛素、胰腺组织免疫组化、体重等方面评价了基因治疗效果。2)Ⅱ型糖尿病模型的治疗研究：选用高脂高糖高胆固醇饮食喂养8周的的方式构建Ⅱ型糖尿病小鼠模型,对模型小鼠以注射30μgDNA、60V电击1次的方法导入exendin-4基因,进行了一次治疗研究,从空腹血糖、血清甘油三酯、空腹胰岛素、体重等方面评价了基因治疗效果。结果：1.体外实验结果表明,转染了GLP-1、exendin-4质粒的C2C12模型细胞相较于未经处理的模型细胞,细胞活力分别增长了50%和140%,葡萄糖利用率分别提高了80%和100%,细胞内TG含量分别下降了125%和200%。治疗后,模型细胞的各项指标与正常细胞没有显著差异。2.Ⅰ型糖尿病小鼠模型治疗结果表明,一次治疗后,实验组小鼠的糖耐量水平显著好转,空腹血糖从25 mmol/1下降到10 mmol/1以下,空腹胰岛素水平从13.02μIU/ml提高到22.97μIU/ml, TG值从2.23 mmol/1下降到1.05 mmol/1,体重增长了10%,约能维持正常水平20天左右。治疗12天时,免疫组化结果表明治疗组小鼠的胰岛能恢复到正常小鼠的1/3大小,但结构相对松散；Real-time PCR的结果表明此时exendin-4基因在治疗组小鼠的胰脏、肌肉、肝脏等器官中相较于正常小鼠约有120倍的表达水平。二次治疗后,实验组小鼠的空腹血糖从30 mmol/l下降到10mmol/l以下,空腹胰岛素水平从17.56μIU/ml提高到26.47/μIU/ml,TG值从2.76 mmol/l下降到1.05 mmol/l,体重增长了10%,约能维持正常水平35天左右。3.Ⅱ型糖尿病小鼠模型治疗结果表明,治疗后,实验组小鼠的空腹血糖从12.48 mmol/l下降到10 mmol/l以下,空腹胰岛素水平从29.82μIU/ml下降到17.97/μIU/ml,TG值从1.57 mmol/l下降到0.81 mmol/l,体重下降了约10%,约能维持正常水平40天左右。结论：通过Ⅰ型体内和Ⅱ型体内、体外模型的研究实验,证明此基因治疗方法可以有效降低糖尿病模型小鼠的空腹血糖水平,并改善模型动物的空腹胰岛素、血清甘油三酯含量和糖耐量等检测指标,并为今后的糖尿病基因治疗研究提供了新的证据和新思路。

论文目录

• 缩略词表
• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 1.糖尿病及其分类
• 2.GL-P1及其类似物
• 3.糖尿病与基因治疗
• 第一部分 标准化SEAP报告基因系统的建立
• 第一节 SEAP酶活力定义标准的建立
• 材料和方法
• 方法
• 结果
• 第二节 SEAP酶活力定义标准的应用
• 材料和方法
• 方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 第二部分 GLP-1及其类似物对糖尿病治疗研究的初探
• 第一节 GLP-1及其类似物exendin-4基因治疗载体的构建及检测
• 材料和方法
• 方法
• 结果
• 第二节 胰岛素抵抗小鼠肌细胞模型的建立
• 材料和方法
• 方法
• 结果
• 第三节 GLP-1及其类似物对成肌细胞株胰岛素抵抗模型的作用研究
• 材料和方法
• 方法
• 结果
• 第四节 GLP-1及其类似物在T1DM模型中的治疗研究
• 材料和方法
• 实验动物
• 方法
• 结果
• 第五节 GLP-1及其类似物在T2DM模型中的治疗研究
• 材料和方法
• 实验动物
• 方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 全文总结
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 致谢
• 在读期间论文发表情况和获奖情况