微流控芯片上单细胞分析的研究

论文摘要

检测单个细胞内化学组分,以及测定单细胞对外界刺激的成分变化,有助于理解基本细胞功能以及细胞内外联系,有助于检测和鉴别大量细胞群体中少量的不正常细胞,因此单细胞的研究在重大疾病早期诊断、治疗、药物筛选和细胞生理、病理过程的研究方面有重要意义,已成为目前生命科学、生化分析等学科研究的热门课题之一。 由于单细胞体积小,胞内物质浓度低,需要高灵敏度的检测方法,如激光诱导荧光（LIF）法。但是大多数胞内组分浓度低又无天然荧光,因此在解决微衍生的问题上还存有相当的空间。 最近,用微流控芯片技术对生物细胞的研究引起了广泛注意,在近些年来得到快速发展。微流控芯片微米尺寸的通道适于单细胞引入,操纵,反应,分离及检测。 本论文首次用芯片毛细管电泳—激光诱导荧光法定量测定了单个人血红细胞内的活性氧（ROS）,将细胞进样、单细胞定位、溶膜和毛细管电泳分离,集成到一块玻璃微芯片完成。ROS包括超氧阴离子(O2·-)、羟自由基（·OH）、过氧化氢等,它不但与衰老、动脉硬化、关节炎、细胞凋亡及癌变等密切相关,并且由于它易扩散和降解,普遍存在于各类细胞中,它还起细胞间信使分子的作用。因此,细胞内ROS的测定已受到普遍重视。我们用可透膜的双氢罗丹明123（DHR 123）作为衍生试剂,DHR 123无荧光,进入细胞后,以细胞本身作为微反应器,和细胞内ROS反应生成荧光产物罗丹明123（Rh 123）,通过微芯片电泳激光诱导荧光法检测细胞内的Rh123,间接对细胞内ROS进行了定量。我们讨论了Rh123迁移时间随pH的变化,得到最佳检测条件,通过标准曲线法,定量测定了单个人血红细胞内ROS。该法由于避免了制备细胞悬液时溶剂的稀释作用,使分析灵敏度大大提高。方法检测下限为0.74amol,每分钟检测两个细胞,连续测定6个单细胞迁移时间的精密度为2.1%。为研究单细胞受外界刺激前后ROS的变化提供了方法和工具。 在微流控芯片单细胞分析中,细胞能够进入微通道是微流控芯片分析细胞的

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• §1.1 引言
• §1.2 芯片和毛细管电泳单细胞组分测定
• §1.2.1 细胞进样
• §1.2.1.1 单细胞溶解进样
• §1.2.1.2 细胞质进样
• §1.2.1.3 单个全细胞进样
• §1.2.2 细胞定位
• §1.2.3 细胞溶膜
• §1.2.4 细胞衍生
• §1.2.4.1 柱前衍生
• §1.2.4.2 柱上衍生
• §1.2.4.3 柱后衍生
• §1.2.5 检测技术
• §1.3 脂质体研究
• §1.3.1 脂质体制备
• §1.3.2 脂质体和细胞作用
• §1.3.3 脂质体在化学领域的应用
• §1.4 参考文献
• 第二章 微流控芯片上单个人血红细胞内ROS的测定
• §2.1 引言
• §2.2 实验部分
• §2.2.1 仪器
• §2.2.2 试剂
• §2.2.3 细胞样品处理
• §2.2.4 分析步骤
• §2.2.4.1 标准溶液测定
• §2.2.4.2 单细胞中ROS的测定
• §2.3 结果与讨论
• §2.3.1 细胞样品处理
• §2.3.2 电泳缓冲溶液
• §2.3.3 定量方法
• §2.3.4 单细胞中ROS的测定
• §2.4 结论
• §2.5 参考文献
• 第三章 用于单个肿瘤细胞分析的新型多深度微流控芯片
• §3.1 引言
• §3.2 实验部分
• §3.2.1 仪器装置
• §3.2.2 多深度微流控芯片的制作
• §3.2.3 试剂
• §3.2.4 细胞内ROS和GSH的标记
• §3.2.5 用多深度微流控芯片检测单细胞
• §3.3 结果与讨论
• §3.3.1 芯片的设计与制作
• §3.3.2 细胞的进样和溶膜
• §3.3.3 用多深度微流控芯片分析肝癌细胞内的ROS和GSH
• §3.4 结论
• §3.5 参考文献
• 第四章 纳米脂质体包裹荧光试剂进入单细胞的研究
• §4.1 引言
• §4.2 实验部分
• §4.2.1 试剂
• §4.2.2 仪器
• §4.2.3 脂质体制备
• §4.2.4 细胞培养
• §4.2.5 脂质体进入细胞的条件测定
• §4.2.6 脂质体作用细胞后细胞活性的测定
• §4.2.7 标准溶液的芯片电泳
• §4.2.8 细胞样品处理
• §4.2.9 单细胞微流控芯片检测
• §4.3 结果与讨论
• §4.3.1 脂质体的制备和性质
• §4.3.1.1 脂质体制备的影响因素
• §4.3.1.2 脂质体的稳定性
• §4.3.1.3 脂质体的包封率和密度
• §4.3.2 脂质体介导荧光试剂进入细胞
• §4.3.3 脂质体介导荧光试剂进入细胞的影响因素
• §4.3.3.1 培养时间的影响
• §4.3.3.2 脂质体浓度的影响
• §4.3.3.3 FITC浓度的影响
• 2+的影响'>§4.3.3.4 Ca²⁺的影响
• §4.3.4 脂质体对细胞活性的影响
• §4.3.5 芯片毛细管电泳激光诱导荧光检测FITC进入细胞后的衍生效果
• §4.4 结论
• §4.5 参考文献
• 第五章 SOD脂质体清除肝癌细胞内活性氧能力在微流控芯片上的测定
• §5.1 引言
• §5.2 实验部分
• §5.2.1 仪器装置
• §5.2.2 试剂
• §5.2.3 SOD的FITC染色
• §5.2.4 脂质体制备
• §5.2.5 脂质体投递SOD进入细胞
• §5.2.6 细胞内ROS和GSH衍生
• §5.2.7 微流控芯片检测单细胞
• §5.3 结果与讨论
• §5.3.1 共聚焦荧光显微镜验证脂质体介导SOD-FITC进入细胞
• §5.3.2 用芯片毛细管电泳测定脂质体密度对SOD—FITC进入细胞量的影响
• §5.3.3 用芯片毛细管电泳测定HepG2肝癌细胞内活性氧
• §5.3.4 用芯片毛细管电泳测定脂质体介导SOD清除细胞内活性氧能力
• §5.3.5 流式细胞仪方法测定脂质体介导SOD清除细胞内自由基能力
• §5.4 结论
• §5.5 参考文献
• 附录
• 致谢
• 独创性声明
• 学位论文版权使用授权书