富硒益生菌制剂工业化生产条件及其抑制致病性大肠杆菌的研究

论文摘要

硒是人和动物所必需的微量元素,具有提高机体免疫力、抗癌、抗自由基、延缓衰老、拮抗有毒元素、防治某些地方性流行病等多种功能.日粮补硒已是许多国家养殖业采取的常规措施,当前广泛使用的补硒方法是在日粮中添加亚硒酸钠,鉴于其结合率低、毒性大、而且会对环境造成潜在的污染,因此已被限量使用。益生菌是一类通过改善动物胃肠道微生物区系平衡而促进动物健康和生长的有益菌。富硒益生菌是利用生物转化的原理,应用益生菌将无机硒转化为有机硒的有机硒制剂,可发挥有机硒和益生菌的双重功效。本研究通过寻找生产富硒益生菌的替代培养基,优化培养条件,以实现工业化生产的目的;并在此基础上研究富硒益生菌在体外、体内抑制致病性大肠杆菌的效果和机理,为其作为临床上预防大肠杆菌病的药物替代品奠定基础。试验1研究了4株益生菌的共生关系及筛选益生菌工业化生产的培养基。将4株益生菌单独和混合培养,通过测定各株益生菌的数量来评价4株益生菌的共生关系;比较益生菌在面粉豆粉培养基、麦芽汁、MRS和YEPD上的生长状况筛选可用于工业化生产的培养基;对比益生菌在不同配比的面粉、豆粉培养基上生长状况筛选出最佳搭配比例;利用正交实验筛选适宜水平的氮、磷、钾及镁以满足益生菌的生长需要。结果表明4株益生菌能较好的共生,面豆粉培养基为较为适宜的工业化生产培养基,培养基成分的最适搭配为:面粉8%、豆粉2%,硫酸铵0.5%、磷酸二氢钾0.1%和硫酸镁0.01%。试验2研究了温度、培养时间、培养基中无机硒浓度、接种量、初始pH对益生菌产量和有机硒转化率的影响。通过单因子试验和正交试验对富硒益生菌的培养条件进行优化来确定工业化生产富硒益生菌的最优培养条件。结果表明在初始pH为6.2面粉培养基,添加4株益生菌、总接种量为5%,培养基中无机硒浓度为10μg·mL-1,温度为34℃,培养时间为36h,在上述培养条件下,4株益生菌数均达到108～10-9CFU·mL-1,有机硒含量达到9.41μg·mL-1、转化率为93.82%。试验3研究了富硒益生菌的生产工艺及其成品稳定性。在特定培养条件下,比较了用发酵罐和锥形瓶培养对益生菌数量和有机硒转化率的影响;当发酵液用玉米粉吸附制成产品后,每隔1个月对产品中有机硒的含量和活菌数进行测定,评价保存时间对产品中益生菌活菌数和有机硒含量的影响。结果表明:在同等条件下,用发酵罐和普通锥形瓶发酵培养富硒益生菌,活菌数和有机硒转化率差异不显著;产品中总硒含量约为50.0ppm,有机硒含量达到约46.32μg·g-1,有机硒转化率约92.64%,4株益生菌的含量分别为5.6×108CFU·g-1,3种乳酸菌La、LGG、St分别达到1.0×1010、2.9×109、5.8×108CFU·g-1;有机硒含量不受保存时间的延长而变化,产品在保存1个月后,酵母菌数量明显下降,数量约为5.1×105CFU·g-1,3个月后La、LGG、St在数量出现明显下降,数量为1.5×109、2.1×107、6.8×107。试验4研究了4株益生菌体外抑制大肠杆菌K88的效果和机理。将各株益生菌单独、4株混合及复合富硒益生菌与K88共培养;取4株益生菌单独和混合以及富硒益生菌培养的发酵滤液用牛津杯法研究体外抑制K88试验,比较不同的培养基制成的发酵滤液对抑菌效果的影响;分别将培养滤液经过乳酸脱氢酶、酸、碱、热处理,对各处理样品进行抑菌效果观察。结果表明:4株益生菌皆具有抑菌功能;富硒益生菌的抑菌能力与混合益生菌无显著差异,其中3种菌的发酵滤液具备抑菌能力;益生菌的抑菌能力在富硒前后及随着培养基的更换没有发生变化;滤液中的抑菌物质热稳定性较好;用乳酸脱氢酶或碱处理后抑菌能力明显下降,用乳酸处理后其抑菌能力有所增加。益生菌通过营养竞争、产生有机酸尤其是乳酸及细菌素对K88进行有效抑制;4株益生菌混合培养生产的发酵滤液的抑菌能力强于单耕培养。试验5研究了富硒益生菌制剂体内抑制致病性大肠杆菌效果和潜在机理。以小鼠为动物模型,将96只昆明系雄性小鼠,随机均分为6组（n=16）:对照组、富硒益生菌组、益生菌组、亚硒酸钠组、有机硒益生素组和药物组,实验期30天。分别于15、30天比较各组小鼠的增重、抗氧化力,血液、肌肉中硒含量及盲肠内容物中的三种肠道固有菌数量;于第30天后,接种大肠杆菌,比较每组的死亡率,计数盲肠内容物中大肠杆菌数,测量各段肠道的pH和脾脏胸腺指数.结果表明:15天后各补硒组抗氧化力、血液硒含量显著升高;15天后补充益生菌的小鼠肠道内菌群结构得到改善,其固有菌群（乳酸菌、酵母菌）显著高于其他组;30天后无机硒和有机硒组中肌肉的硒含量显著高于对照组但低于富硒益生菌,富硒益生菌对小鼠的增重影响显著高于其他组;接种大肠杆菌后,富硒益生菌组中小鼠的死亡率最低,盲肠内容物中大肠杆菌的数量最少。富硒益生菌可以明显提高小鼠的生长性能和机体的抗氧化力和免疫力,抑制致病菌在体内定植。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 符号及缩略语说明
• 前言
• 第一章 文献综述
• 一、硒的研究进展
• 二、益生菌研究进展
• 三、工业化生产富硒益生菌的进展
• 第二章 4株益生菌共生及工业化生产所用培养基的研究
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 3 讨论
• 参考文献
• 第三章 富硒益生菌制剂工业化加工工艺的探索
• 1 材料与方法
• 2 结果与讨论
• 3 结论
• 参考文献
• 第四章 富硒益生菌制剂的加工及其稳定性的研究
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 3 讨论
• 参考文献
• 第五章 富硒益生菌制剂体外抑制致病性大肠杆菌的效果与机理研究
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 3 讨论
• 参考文献
• 第六章 富硒益生菌制剂预防小鼠感染致病性大肠杆菌效果的观察
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 3 讨论
• 参考文献
• 全文结论
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表的文章