突环嫁接产生“双功能”酶和“双中心”酶

论文摘要

近年来,工程酶的研发已由过去主要针对蛋白质骨架的修饰转向对酶的活性部位改进上。本研究以人溶菌酶（EC 3.2.1.17）为模型,通过合理设计构建“双中心”酶和“双功能”酶。人溶菌酶是一种重要的药用酶,已成为研究基因与蛋白质结构关系的经典模型。人溶菌酶基因包含四个外显子,其中外显子2为氨基酸28-82编码,包括催化中心的残基（Glu35和Asp53）,且Cys65-Cys81之间形成一段突环（loop）结构。我们将编码活性中心的外显子2重复嫁接到该突环中（Val74-Asn75密码间）,获得“双中心”溶菌酶HLY-E2基因,在大肠杆菌中表达后进行活性检测和稳定性分析。结果表明HLY-E2的相对活性是野生型人溶菌酶的211.5% ,且稳定性与野生型相似。利用定点突变并结合计算机模拟结果,证明HLY-E2确实存在两个活性中心。我们在对核酶的研究过程中发现锤头核酶能够编码具有催化活性的多肽,因此我们将由核酶编码的具有类似核酸酶活性的多肽称为核肽酶（ribopepzyme）。用同样方法将核肽酶的编码基因嫁接到溶菌酶的突环基因中,构建“双功能”酶基因,经诱导表达和纯化后获得“双功能”酶HLY-RD和HLY-2R。实验结果表明HLY-RD和HLY-2R同时具有溶菌酶的裂解活性和类核酸酶活性。因为自然界中大多数蛋白质（酶）都具有突环结构,所以工程原有突环为酶的新活性部位可能具有普遍意义。上述研究为获得“双中心”或“双功能”酶提供一条捷径。

论文目录

• 提要
• 第一章 绪论
• 1.1 概述
• 1.2 溶菌酶简介
• 1.2.1 溶菌酶的分类
• 1.2.2 溶菌酶的组成及性质
• 1.2.3 溶菌酶的基因、结构与功能
• 1.2.4 溶菌酶的应用
• 1.2.5 溶菌酶的表达
• 1.3 核肽酶简介
• 1.4 研究内容
• 第二章 实验材料
• 2.1 仪器与试剂
• 2.1.1 实验仪器
• 2.1.2 试剂及配制方法
• 2.1.3 酶和其它试剂及来源
• 2.2 菌株和质粒
• 第三章“双功能”酶与“双中心”酶的构建和表达
• 3.1 实验设计
• 3.2 “双功能”酶基因的构建和表达
• 3.2.1 “双功能”酶基因的构建
• 3.2.2 HLY-RD（HLY-2R）基因的表达
• 3.2.3 目的蛋白的纯化
• 3.2.4 实验结果
• 3.3 “双中心”酶基因的构建和表达
• 3.3.1 “双中心”酶基因的构建
• 3.3.2 “双中心”酶基因的表达
• 3.3.3 目的蛋白的纯化
• 3.3.4 实验结果
• 第四章“双功能”酶的酶学性质及结构与功能的研究
• 4.1 “双功能”酶的酶学性质
• 4.1.1 “双功能”酶的溶菌酶活性测定[82]
• 4.1.2 “双功能”酶针对溶菌酶活性的热稳定性研究.
• 4.1.3 “双功能”酶针对溶菌酶活性的pH 稳定性研究
• 4.1.4 体外类RNase 活性检测
• 4.2 HLY-RD（HLY-2R）结构与功能研究
• 4.2.1 HLY-RD（HLY-2R）圆二色谱的测定
• 4.2.2 HLY-RD（HLY-2R）荧光光谱的测定
• 4.2.3 HLY-RD（HLY-2R）紫外吸收光谱的测定
• 4.2.4 三级结构的模拟
• 4.3 实验结果与讨论
• 4.3.1 HLY-RD（HLY-2R）的酶学性质
• 4.3.2 HLY-RD（HLY-2R）结构与功能研究
• 4.3.3 讨论
• 第五章 “双中心”酶双活性中心的确定及性质功能研究
• 5.1 双活性中心的确定
• 5.1.1 实验原理
• 5.1.2 “双中心”酶基因突变体的构建
• 5.1.3 “双中心”溶菌酶突变体在大肠杆菌中的诱导表达
• 5.1.4 “双中心”溶菌酶突变体的纯化
• 5.1.5 “双中心”溶菌酶突变体活性分析
• 5.1.6 实验结果与讨论
• 5.2 “双中心”溶菌酶的酶学性质
• 5.2.1 “双中心”溶菌酶热稳定性的测定
• 5.2.2 “双中心”溶菌酶pH 稳定性的测定
• 5.2.3 金属离子对“双中心”溶菌酶活性的影响
• 5.2.4 实验结果与讨论
• 5.3 “双中心”酶结构与功能研究
• 5.3.1 三级结构的模拟
• 5.3.2 HLY-E2 的圆二色谱
• 5.3.3 HLY-E2 的荧光光谱
• 5.3.4 实验结果与讨论
• 第六章 结论
• 参考文献
• 摘要
• Abstract
• 致谢
• 攻读博士期间发表的论文