付东杰
(黑龙江省双鸭山煤炭总医院155100)
【关键词】HLA分子生物学检测临床分析
【中图分类号】R446.1【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2014）10-0245-02
1.概述
个体HLA遗传学差异的本质在于编码其抗原产物的基因上，所以分析个体HLA的基因型无疑是对HLA型别分析的最准确的方法，其准确性远高于血清学与细胞学分型。自1996年第12届国际组织相容性研讨会后，以DNA为基础的HLA基因分型技术日趋成熟，并逐渐取代血清学方法。DNA分型方法需要的血样少，样本可长期保存，相应的分型试剂可大量制备，来源不受限制。特别重要的是DNA分型精确可靠，重复性好，其分型错误率远低于血清学方法。DNA分型技术已在实际工作中得到了广泛的应用。HLA基因分型中，一般将检测到“*”后第2位称为低分辨分型或抗原分解物水平分型。检测到“*”后第4到第8位，叫高分辨分型或等位基因水平分型。介于高低之间的为中间分辨分型。HLA的DNA分型方法目前有多种，基本上可分为两种类型：一类是以鉴别HLA基因序列不同为基础的HLA分型技术，另一类基于不同HLA等位基因在聚丙烯酰胺凝胶电泳中具有不同的构象而设计的[1]。
2.HLA的分子生物学检测方法
2.1PCR指纹技术
1991年召开的国际组织相容性专题研讨会上，PCR指纹技术被正式列为HLA基因型别鉴定方法之一。这一技术是基于在特异性扩增DNA最后一个循环阶段的退火期，其单链DNA除形成同一个体的完全互补的同质双链外，某些单链DNA还可以与不同个体的单链DNA形成不完全的互补异质双链，不同个体有不同分子构象，在非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳中呈现特异的电泳图谱，这些电泳图谱称为PCR指纹。PCR指纹技术可以像混合淋巴细胞培养方法一样，无需知道供受体确切型别或等位基因特异性，即可通过PCR扩增后，在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中直接判断供受体相应基因相容性。耗时较短，也无需使用探针、限制性核酸内切酶、同位素等，具有快速、简便、经济、直接等优点。本方法无法确切指定HLA的等位基因型别，目前仅作为器官移植配型的补充技术[2]。
2.2PCR单链构象多态性
该方法是指在不含变性剂的中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，单链DNA形成一定的空间结构，具有一定的构象。单链DNA因碱基顺序不同或碱基不同所形成的构象不同，泳动速度也不同，通过PCR扩增HLA等位基因的碱基的置换部位及两侧DNA片段，变性后进行SSCP分析，可有效检出DNA点差异。PCR－SSCP法适合含量小的标本，或可作为检测是纯合子还是基因缺失的补充实验。该法仅能探知基因变异的存在，而无法确定变异的确切位置及内容。本方法主要用于检测供受者基因是否相配，常作为HLA其他基因分型方法的补充，用于区分纯合基因和空白基因，同时可用于发现和确认新的等位基因和变异体。本方法的缺点为不能确切指定HLA的等位基因型别。
2.3单核苷酸多态性检测技术
单核苷酸多态性(SNP)是指DNA序列中单个核苷酸的差别，存在于编码区内的称为cSNP。SNP被誉为继STR之后的第三代遗传标记。开发HLA区域的SNP有利于免疫相关疾病的准确定位及HLA单体型的研究等，目前在HLA－I类区域内已发现SNP密度是1个SNP／400bp，远大于基因组内其他区域已发现的SNP密度。第13届国际组织相容性专题研讨会上的目标是制作HLA区域内高密度SNP图，用目前存在的方法发展HLA－SNP分型试剂盒，目前该方法尚处于实验阶段。HLA基因分型准确率高，有关HLA的DNA分型方法很多，但是在实际分型工作中常见的分型方法主要为PCR－SSP、PCR－SSOP、流式细胞术、PCR－SBT、基因芯片等。不同的实验室可根据实际情况选择分型方法，但是不论何种方法，都需要有一定数量的已知样本或标准品作质量控制，以保证分型结果的准确与可靠。
3.HLA高分辨分型中模棱两可结果的原因及策略
HLA具有高度遗传多态性。在HLA基因分型方法中，由于分型方法本身的特性，有时会得到模棱两可的分型结果，不能明确地指定为某一基因型。它们基本上发生在高分辨率分型，即等位基因分型*后4位分型。在低分辨分型方法中模棱两可的问题，一般可以通过增加引物或探针进行克服。
3.1模棱两可结果产生的原因
3.1.1PCR－SSP中的模棱两可结果PCR－SSP分型的引物特性类似于血清学分型的抗体，可有“单价”和“多价”之分。前者只扩增某独一无二的基因，而后者可扩增数个等位基因，因此会产生模棱两可的分型结果，难以定型，特别是某些引物可干扰结果的判断，最终得不到明确的结果。
3.1.2PCR－SSOP中的模棱两可结果HLA的每个等位基因都具有各自独特的基元序列。PCR－SSOP方法使用一系列顺序特异性探针，与相应的等位基因杂交。这些探针有的类似单价抗体，只与某一等位基因的基元序列杂交，因此凡与此探针杂交呈阳性反应，即可明确无误地指定相应等位基因。但是其他大多数探针类似多价抗体，能够与一种以上的基元序列杂交，产生错综复杂的杂交格局。在相应探针无法区分时，可导致产生模棱两可的分型结果。
3.2模棱两可结果区分的策略
分型方法产生模棱两可结果后不能得到明确的HLA分型结果，对于模棱两可的结果可以通过以下方法进行区分：采用PCR－SSP进行低分辨检测，结合低分辨的结果可加以区分；采用型特异性引物进行扩增，然后在组内进行分析改用其他厂家的试剂，由于每一个厂家探针或引物的组合不同，改用其他厂家后可能能够区分；增加测序的范围或杂交的探针数；克隆转染后形成单链后检测；多种方法结果进行综合判断。
参考文献
[1]黄瑞钦.人类白细胞抗原(HLA)[J].广州医学院学报,1982年02期.
[2]彭容成,王家英.人类白细胞抗原[J],济宁医学院学报,1987年02期.