棉花纤维发育相关基因GhKCS13的克隆与功能验证

论文摘要

棉纤维是从胚珠表皮细胞分化而来的单细胞结构,其发育过程可分为纤维起始、纤维细胞的伸长、次生细胞壁的加厚和脱水成熟4个重叠时期,从分子水平上揭示棉纤维细胞发育的调控机制,具有重要的理论意义和实践价值。虽然脂类代谢可能是棉花纤维发育中的一个重要因素,但是这一方面受到很少的关注。β-酮脂酰-CoA合成酶（KCS）可能是超长链脂肪酸合成的限速酶,因此研究缩合酶KCS的作用机理具有重要意义。在本研究中,我们从棉花陆地棉标准系TM-1 cDNA中分离了编码超长链脂肪酸（VLCFA）合成酶基因GhKCS13,利用RT/Real-time PCR分析了GhKCS13在陆地棉TM-1和海岛棉标准系3-79不同组织中的表达丰度,结果显示这个基因主要在纤维中表达,受棉花纤维发育阶段调控,并在纤维快速伸长期优势表达。生物信息学方法分析结果表明GhKCS13基因具有KCS基因家族保守结构域,含有两个膜结合区域,定位于内质网（ER）上为了研究GhKCS13基因在棉花纤维发育中的作用,我们利用DNA重组技术,构建了两种超表达载体,其中一种是以GhKCS13基因的ORF序列构建的CaMV35S（花椰菜花叶病毒启动子）驱动的植物组成型超表达载体35S::GhKCS13,另外一种是以纤维前中期优势表达启动子构建的表达载体pEXA1::GhKCS13;并将GhKCS13基因特异的3’-UTR序列运用BP反应构建CaMV35S驱动的RNAi干涉载体。然后用农杆菌遗传介导法转化棉花下胚轴,经过多次继代培养,获得一批转基因再生棉花植株。TO转基因植株的Southern blot拷贝数检测结果显示：35S::GhKCS13超表达载体中有1个转化事件是单拷贝,1个转化事件是双拷贝；纤维优势表达载体pEXA1::GhKCS13中有4个不同的转化事件是单拷贝,3个不同的转化事件是双拷贝；35S RNAi干涉载体有9个不同的转化事件是单拷贝,1个转化事件是双拷贝。我们利用RT/Real-time PCR技术分析了转基因TO植株10DPA纤维中GhKCS13转录物的变化,发现GhKCS13在35S超表达和pEXA1纤维优势表达植株中微量上调表达,而在RNAi植株的10DPA纤维中明显下调；同时我们也发现35S超表达植株的叶片中GhKCS13明显上调表达,且出现叶片逐渐卷曲死亡的表型。同样,我们利用RT/Real-time PCR分析乙烯合成相关基因在GhKCS13转基因植株中表达水平的变化,发现主要是GhACO3在叶片中轻微上调表达；转基因植株10DPA的纤维中,GhACO1、GhACO3和GhACS6在两种超表达植株中上调表达,在干涉植株中下调表达不明显。RT-PCR结果显示主要是GhACO1基因在纤维中表达。根据本研究的实验结果,我们推测GhKCS13基因在棉花纤维和叶片发育中可能发挥着重要作用；在叶片中超量表达后会导致植株叶片的早衰,它的表达丰度可能在调节叶片发育中起着关键作用；GhKCS13基因可能通过调节乙烯合成途径相关基因的表达来实现对叶片和纤维的发育的调节,在叶片中可能主要通过GhACO3基因实现其调节作用,在纤维中主要通过GhACO1基因实现其调节作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 1 前言
• 1.1 棉花纤维发育机制研究
• 1.1.1 棉花纤维发育概述
• 1.1.2 棉花纤维发育的过程及其分子机制
• 1.1.3 棉花纤维线性生长模式
• 1.1.4 乙烯在棉花纤维发育中的作用
• 1.2 VLCFA在植物发育中的作用
• 1.2.1 VLCFA的合成
• 1.2.2 VLCFA在植物发育中的作用
• 1.3 KCS研究进展
• 1.4 VLCFA与KCS在棉花纤维发育中的作用与研究进展
• 1.4.1 脂肪酸及VLCFA在棉花纤维发育中的作用
• 1.4.2 KCS在棉花纤维发育中的研究进展
• 1.5 VLCFA与乙烯之间的关系
• 1.6 研究目的与意义
• 1.7 技术路线
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 基因来源
• 2.1.2 棉花材料
• 2.1.3 菌株和载体
• 2.1.4 主要试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 载体构建方法
• 2.2.1.1 载体构建策略
• 2.2.1.2 引物设计
• 2.2.1.3 PCR产物的TA克隆、测序
• 2.2.2 运用Gateway（?）技术构建表达载体
• 2.2.2.1 BP-LR重组反应原理
• 2.2.2.2 表达载体的构建
• 2.2.3 农杆菌介导的棉花下胚轴遗传转化
• 2.2.4 DNA的提取
• 2.2.4.1 DNA的抽提及纯化
• 2.2.4.2 DNA浓度的测定
• 2.2.5 转基因植株的阳性检测
• 2.2.6 Southern blot
• 2.2.6.1 Southern blot探针制备
• 2.2.6.2 Southern blot
• 2.2.7 RNA的提取及纯化
• 2.2.7.1 RNA的提取
• 2.2.7.2 RNA的纯化
• 2.2.8 RNA的反转录
• 2.2.9 RT/Real time PCR
• 2.2.9.1 RT-PCR
• 2.2.9.2 Real time PCR
• 3 结果与分析
• 3.1 生物信息学分析表明GhKCS13可能定位于内质网
• 3.1.1 GhKCS13核苷酸序列分析和氨基酸序列预测
• 3.1.2 GhKCS13蛋白质保守结构域和进化树分析
• 3.2 GhKCS13在棉花纤维伸长期优势表达
• 3.3 GhKCS13超表达及抑制表达转基因棉花的获得
• 3.3.1 GhKCS13表达载体的构建
• 3.3.2 GhKCS13转基因棉花的获得
• 3.4 T0转基因再生植株Southern blot检测
• 3.4.1 T0转基因再生植株快速PCR阳性鉴定
• 3.4.2 T0转基因再生植株Southern blot检测
• 3.5 35S::GhKCS13超表达转基因棉早衰
• 3.6 GhKCS13在超表达转基因棉花纤维中表达量上调不明显
• 3.7 RNAi转基因棉花GhKCS13在纤维中表达量被明显抑制
• 3.8 35S::GhKCS13超表达转基因棉花GhKCS13在叶片中表达量上调明显
• 3.9 改变GhKCS13的表达模式影响乙烯合成途径相关基因的表达
• 3.9.1 35S::GhKCS13超表达转基因植株叶片中GhACO3上调表达
• 3.9.2 超表达转基因植株纤维中GhACO1、GhACO3和GhACS6上调表达
• 3.9.3 RNAi转基因植株纤维中GhACO1、GhACO3和GhACS6下调表达不明显
• 4 讨论
• 4.1 超表达GhKCS13引起乙烯合成相关基因在叶片中上调表达,导致叶片早衰
• 4.2 乙烯的产生在GhKCS13转基因植株纤维中有一个内源平衡过程
• 4.3 关于GhKCS13基因研究的展望
• 参考文献
• 附录
• 附录1 缓冲液配方
• 附录2 棉花转化相关培养基配方
• 附录3 50ul DNA酶切检测体系
• 附录4 DNA变性液及转膜液配方
• 附录5 50ul Southern blot探针标记体系（Promega labeling kit）
• 附录6 Southern blot洗膜液配方
• 附录7 RNA提取相关溶液的配方
• 附录8 常用储存液
• 附录9 常用缓冲液
• 致谢