肝螺杆菌甲基基团接受趋化信号转导蛋白多克隆抗体的制备及鉴定

论文摘要

目的和意义肝螺杆菌（Helicobacter hepaticus, Hh）致病机制及流行病学特征尚不完全清楚。本研究通过制备肝螺杆菌甲基基团接受趋化信号转导蛋白（methyl-accepting chemotaxis signal transduction protein, MCP）兔抗血清,为进一步探讨肝螺杆菌在实验动物及人类的感染及及临床检测试剂盒的开发提供实验基础。材料和方法1、主要材料：细菌菌株（肝螺杆菌、幽门螺杆菌）,空肠弯曲菌琼脂基础,弗氏完全/不完全佐剂,辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG。Balb/C小鼠,新西兰大白兔。2、方法2.1细菌分离及培养2.1.1胆型螺杆菌的分离及鉴定参照文献方法分离胆型螺杆菌。SPF （special pathogene free）级Balb/C小鼠禁食48h后,取肠道组织匀浆,涂布于空肠弯曲菌选择性血琼脂培养基（含7%冻融脱纤维羊血,选择性抗生素万古霉素10mg/L,多粘菌素B 2500单位/L,二性霉素B 10mg/L, TMP 5mg/L）,37℃微需氧条件（5%O2.10%CO2及85%N2）下培养3-5天,每天观察有无菌落生长。挑取可疑菌落传代培养。细菌鉴定：1、形态鉴定可疑细菌涂片革兰染色,油镜下观察细菌形态。2、生化鉴定可疑细菌行快速尿素酶、氧化酶、过氧化物酶及硝酸还原酶实验（检测试剂盒由环凯生化公司提供）3、PCR扩增细菌16srRNA基因将透明、针尖大小的菌落用棉签刮至EP管中,PBS冲洗三次后,用细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌DNA。以可疑菌基因组DNA为模板,采用螺杆菌属特异性引物行PCR扩增。反应条件为94℃10min总变性,94℃30s,54℃30s,72℃55s,共35个循环,72℃10min总延伸。扩增产物于1.5%琼脂糖凝胶中电泳,电泳条件80V,30min。阳性结果测序分析（测序工作由英俊生物公司完成）。2.1.2细菌传代培养取肝螺杆菌、胆型螺杆菌、幽门螺杆菌保种液各100μl涂布于空肠弯曲菌选择性血琼脂培养基,37℃微需氧条件下培养3天,细菌涂片革兰染色观察细菌生长情况。2.2提取细菌外膜蛋白（cell surface proteins,CSPs）细菌在空肠弯曲菌选择性血琼脂培养基培养（培养条件同前）48-72h后,用灭菌双蒸水洗刮下菌苔,室温4000 r/min,20 min离心洗涤菌液。重复洗涤一次。弃上清,收集菌泥,称重,按每4g菌泥加入0.2mol /L、pH 2.2甘氨酸-盐酸缓冲液100 ml,4℃磁力搅拌30 min,后在4℃条件下12000 r/min,离心15 min。透析,冷冻干燥法浓缩。BCA法测蛋白浓度。2.3 MCP基因在大肠杆菌中的表达将我室保种的重组质粒pET22b+/MCP转化大肠杆菌感受态BL21（DE3）,挑单克隆接种于10ml含氨苄青霉素100μg/ml的LB培养基,37℃200rpm培养3个半小时至OD600约为0.6-1.0。转接100μl于10ml含氨苄青霉素100μg/ml的LB培养基中,37℃200rpm培养1.5小时至OD600约为0.6,加入500mmol/L IPTG至终浓度为1mmol/L,37℃180rpm震荡培养4小时。将诱导菌液12000rpm 4℃离心5min,取1ml菌液沉淀进行SDS-PAGE鉴定。重组蛋白rhMCP包含表达载体pET22b（+）中的6×His标签,因此用Western blot对rhMCP的表达再次进行鉴定。2.4 rhMCP蛋白的纯化取1000ml诱导表达的菌液,12000rpm 4℃离心5min,菌体沉淀加入1/20细菌生长体积的细菌裂解液和PMSF,冰上超声破碎细菌,10000rpm 4℃离心15min。弃上清,往沉淀中加入1/20细菌生长体积的UrNTA-0 Buffer和PMSF,将细胞悬浮,室温放置30min, 10000rpm 4℃离心15min,取上清。用30ml的UrNTA-0 Buffer平衡3ml NTA层析柱,上清液上柱,收集穿透部分,用于SDS-PAGE分析蛋白质的结合情况。15ml UrNTA-0 Buffer洗脱未结合部分,然后分别用15mlUrNTA-20, UrNTA-40, UrNTA-60, UrNTA-100, UrNTA-200, UrNTA-500洗脱,收集洗脱液,用SDS-PAGE确定目标蛋白质在洗脱液中的分布情况。用梯度PBS-尿素4℃透析（6M-4M-2M-1M）,每4小时换液一次,最后用PBS 4℃透析24小时。BCA法测蛋白浓度,-70℃保存。2.5兔抗重组融合蛋白MCP抗血清的制备取MCP重组蛋白800μl（约800μg）与800μl弗氏完全佐剂彻底乳化,经背部皮下多点注射新西兰白兔。首次免疫后4周取纯化的融合蛋白MCP 400μl（约400μg）与400μl弗氏不完全佐剂彻底乳化,进行第2次免疫,之后第6,8周分别用MCP加上等体积弗氏不完全佐剂加强免疫,最后一次免疫不加佐剂。最后1次加强免疫后5-7天耳缘静脉采血2mL,行Western blot检测血清中是否有特异性抗体,并用间接ELISA法测定血清中抗体的效价。检测到特异性抗体后颈动脉插管放血,分离血清,置-80℃保存。2.6 ELISA法测定效价纯化的融合蛋白MCP按5μg/ml,50μl/孔,包被酶标板,分别加人不同倍数稀释的血清,PBST冲洗后加HRP标记的羊抗兔IgG二抗孵育,最后加TMB底物液显色,终止后用酶标仪测定OD450nm,以等于阴性对照孔的2.1倍者判为阳性。2.7兔抗融合蛋白MCP抗体的纯化2.7.1饱和硫酸铵法初纯抗体往10ml免疫兔血清中加等量的PBS（pH7.4）;逐滴加入等量饱和硫酸铵溶液,于4℃静置30min; 4℃2000rpm/min离心15 min;弃上清,沉淀用20 ml预冷的PBS溶解,逐滴加入10mL饱和硫酸铵溶液,置4℃冰箱30min; 2000rpm离心15min,收集沉淀,沉淀用20ml预冷的PBS溶解,获得初步纯化的IgG抗体溶液。2.7.2抗原特异性纯化法纯化抗体先用PH8.3的碳酸盐缓冲液预平衡CNBr-activated Sepharose 4B层析柱,加入纯化的MCP蛋白5mg,4℃过夜。次日离心去除未结合的蛋白,封闭非特异结合位点后加入粗纯抗体5mL于4℃摇床过夜。向柱中加入洗脱液离心后,吸取上清即为能与重组蛋白MCP特异结合的兔抗MCP抗体。加入等体积的甘油及叠氮钠至终浓度0.02%,分装后-70℃保存。2.8兔抗MCP抗体的特性鉴定Western blot检测抗体特异性取MCP重组蛋白、肝螺杆菌、幽门螺杆菌、及胆型螺杆菌菌体外膜蛋白CSPs变性后行SDS-PAG凝胶电泳,电转移至PVDF膜,以封闭液（50 mmol/L Tris-Buffered-Saline, pH7.5,含1%BSA和0.1% Tween20）于37℃振荡封闭2h,再加入以封闭液稀释（1：500）的兔抗MCP纯化抗体,于4℃孵育过夜,洗膜后加1：5000稀释的HRP-羊抗兔IgG（武汉博士德公司产品）于37℃温育1h,充分洗涤后ECL发光,显影。结果1、胆型螺杆菌的分离及鉴定可疑细菌在空肠弯曲菌选择性血平板上微需氧培养3天后,肉眼可见针尖大小、雾状透明菌落,细菌涂片革兰染色（图3-1）,见细菌革兰染色阴性,呈“S”或“C”形,与幽门螺杆菌相似,但菌体更细长,螺旋也较多。生化鉴定示细菌尿素酶实验阳性,氧化酶、过氧化物酶实验阳性,硝酸还原酶阴性。采用螺杆菌属特异性引物及胆型螺杆菌特异性引物扩增16s rRNA,1.5%琼脂糖凝胶电泳,于780b有阳性条带（图3-2,图3-3）,产物测序结果与GeneBank库中基因组同源性对比,结果与Helicobacter bilis ATCC43879同源性达到99%,证实本实验所分离的细菌即为胆型螺杆菌（图3-4）。肝螺杆菌、胆型螺杆菌及幽门螺杆菌在空肠弯曲菌血平板上培养3天后,肉眼可见针尖大小、雾状透明菌落。2、细菌菌体外膜蛋白CSPs的制备制备的细菌外膜蛋白经过浓缩后行SDS-PAGE电泳,考马斯亮蓝染色结果如图3-5所示。3、重组融合蛋白的诱导表达经IPTG诱导后,含重组质粒的大肠杆菌E.coli BL21（DE3）能够表达相对分子质量M:14118D的重组蛋白rhMCP,前期试验鉴定rhMCP是以不可溶性的包涵体形式存在。经Western blot鉴定,在约14 KD处可见一特异性条带。4、重组蛋白的分离纯化由于诱导表达的rhMCP是以不可溶的包涵体形式存在,因此用8M尿素溶解包涵体,再按变性蛋白纯化方法进行梯度尿素洗脱,其中以UrNTA200（咪唑浓度为200mM）洗脱效果最佳,纯化后的rhMCP用透析袋进行梯度尿素-PBS透析复性,复性后得到可溶性rhMCP,用BCA法测蛋白浓度为2.08mg/ml。5、兔抗MCP多克隆抗体的制备纯化用纯化的融合蛋白His-MCP作抗原,免疫大白兔,所得的多克隆抗血清,行Western blotting及EL1SA检测（图3-6,图3-7）,可见14KD处有特异性条带,抗血清的效价为1：32000,证明该实验制备成功高特异性、高效价的兔抗MCP多克隆抗体。6、Western blotting进一步分析抗体特异性用制备的细菌外膜蛋白CSPs及MCP行SDS-PAGE电泳后,转移至PVDF膜上,依次加入制备的一抗及羊抗兔二抗后,ECL发光,胶片感光、显影,见肝螺杆菌及MCP蛋白在14KD处可见特异性条带,而胆型螺杆菌及幽门螺杆菌无条带,表明所制备的抗体具有较好的活性,可与免疫原特异性结合（图3-8）。结论本研究中成功从Balb/c小鼠结肠中分离出胆型螺杆菌。利用分离纯化后的重组蛋白MCP免疫新西兰大白兔,成功获得抗MCP的多克隆抗体血清,该抗体特异性强,纯化后用Western blotting检测只有一条特异性条带,且效价为1：32000（ELISA法）。再后来的实验中我们发现该抗体用于Western blotting检测细菌外膜蛋白CSPs,只有肝螺杆菌组有阳性条带,说明该抗体与其他常见螺杆菌属无交叉反应。故本实验为进一步深入研究肝螺杆菌的流行病学及制备简便的检测试剂盒提供了重要的实验基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 第二章 材料与方法
• 一、材料
• 二、实验方法
• 第三章 结果
• 一、胆型螺杆菌的分离及鉴定
• 二、多克隆抗体的制备及鉴定
• 第四章 讨论
• 全文小结
• 参考文献
• 附录
• 致谢