论文摘要
研究背景气道黏液高分泌是哮喘（asthma）、慢性阻塞性肺疾病（Chronic obstructivepulmonary diseases,COPD）、囊性纤维化（Cystic fibrosis,CF）等慢性气道疾病共同的重要病理特征,但目前仍缺乏有效的治疗手段。阐明气道黏液合成的调控机制,将为气道黏液高分泌提供新的靶点治疗,对开发有效抑制气道黏液高分泌的新药物具有重要意义。黏蛋白MUC5AC是气道黏液的主要成分,所以研究其表达的调控机制尤为重要。多种细菌均可诱导MUC5AC表达上调,包括致呼吸道感染的常见细菌铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa,PA）及其胞壁成分脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）,但目前PA-LPS上调气道黏蛋白MUC5AC的分子机制尚未阐明。既往研究虽证实PA-LPS通过肿瘤坏死因子α转化酶（Tumornecrosis factorαconverting enzyme,TACE）→转化生长因子-α（Transforminggrowth factor-α,TGF-α）→表皮生长因子受体（Epidermal growth factor receptor,EGFR）信号通路诱导气道上皮细胞MUC5AC高表达,但对于PA-LPS通过何种信号途径导致TACE活化进而激活下游的信号分子尚未明确。最近有研究发现活性氧（Reactive oxygen species,ROS）可直接活化TACE,并阐明ROS→TACE→TGF-α→EGFR信号通路介导香烟烟雾、中性粒细胞弹性蛋白酶（Neutrophil elastase,NE）上调气道上皮细胞黏蛋白MUC5AC表达。鉴于既往研究显示LPS可诱导气道上皮细胞ROS的合成,故本课题设想ROS也在PA-LPS上调气道MUC5AC中具有关键作用。NADPH氧化酶（NADPH oxidase,Nox）是调控细胞ROS合成的主要酶蛋白之一,Nox家族包括多种同源蛋白,其中在气道上皮细胞表达的为Dual oxidase（Duox,包括两种亚型Duox1及Duox2）,研究表明Duox负责调控气道上皮细胞ROS的合成,那么Duox是否参与了MUC5AC表达的调控?最近研究发现蛋白激酶C（Protein kinase C,PKC）可激活Duoxl,并阐明PKC→Duox1→ROS→TACE→TGF-α→EGFR信号通路介导NE上调MUC5AC,所以本课题拟探讨该通路在PA-LPS诱导MUC5AC表达中的重要作用。LPS通过Toll样受体4（Toll-like receptor 4,TLR4）诱导各种病理生理反应,最近一系列研究证实TLR4与Nox家族存在信号串话,如Park HS等通过酵母双杂交技术证实TLR4与Nox4存在信号串话,并介导LPS诱导T细胞ROS的生成;又如Pacquelet S等揭示TLR4可以通过其下游的IRAK磷酸化Nox4的胞浆组分p47phox,进一步阐明了TLR4与Nox4信号串话的分子机制。因此本课题设想PA-LPS可能通过TLR4与Duox1的信号串话诱导气道上皮细胞MUC5AC的表达。本课题拟探讨TLR4、PKC、Duox1、ROS在PA-LPS诱导气道上皮细胞MUC5AC表达中的重要作用及其相互关系,进一步阐明PA-LPS上调气道黏蛋白MUC5AC表达的分子机制。第一部分:ROS在PA-LPS上调气道上皮细胞黏蛋白MUC5AC表达中的作用目的探讨ROS在PA-LPS诱导气道上皮细胞TGF-alpha合成、黏蛋白MUC5AC表达中的作用。方法以PA-LPS干预气道黏液上皮癌细胞株NCI-H292细胞,干预2h后检测细胞上清液H2O2的生成;干预4h后ELISA检测细胞上清液中TGF-alpha的含量;干预12h后RT-PCR检测MUC5AC mRNA的表达;干预24h后免疫细胞化学检测细胞MUC5AC蛋白的表达。采用ROS清除剂二甲基硫脲（1,3-dimethyl-2-thiourea,DMTU）预先干预NCI-H292细胞30min,然后再加入PA-LPS共同干预细胞并检测TGF-alpha的生成、MUC5AC mRNA及蛋白的表达情况。以含MUC5AC 5’端3.7kb的荧光素酶报告基因质粒（pMUC5AC 3.7kb-luc）转染结肠癌细胞株HM3细胞,转染24h后分别以PA-LPS及不同浓度的H2O2干预5h,然后液闪计数仪下检测细胞荧光素酶的发光强度以明确MUC5AC的转录活性。以DMTU预先干预转染的HM3细胞30min,再加入PA-LPS共同干预5h,然后检测细胞荧光素酶的发光强度。结果PA-LPS干预后,NCI-H292细胞上清液中H2O2、TGF-alpha的含量、细胞MUC5AC mRNA及蛋白水平的表达均明显上调（p＜0.01）。ROS清除剂DMTU可明显抑制PA-LPS对NCI-H292细胞TGF-alpha、MUC5AC mRNA及蛋白水平表达的上调（p＜0.01）。PA-LPS及不同浓度的H2O2均明显上调MUC5AC 3.7kb-luc转染的HM3细胞中MUC5AC的转录活性,DMTU也可明显抑制PA-LPS及H2O2对MUC5AC转录活性的增强。结论ROS可通过调控TGF-alpha的合成介导PA-LPS对气道上皮细胞黏蛋白MUC5AC表达的上调,而且ROS也介导了PA-LPS对MUC5AC转录活性的增强。因此本研究表明氧化应激在PA-LPS导致的气道黏液高分泌中具有关键作用。第二部分:TLR4-PKC-Duox1信号通路在PA-LPS上调气道上皮细胞黏蛋白MUC5AC表达中的作用目的探讨TLR4-PKC-Duox1信号通路在PA-LPS上调气道上皮细胞ROS、TGF-alpha合成及黏蛋白MUC5AC表达中的作用。方法分别采用Nox的抑制剂Apocynin、PKC的抑制剂BisindolylmaleimideⅠ预先干预NCI-H292细胞30min,然后再加入PA-LPS共同干预细胞,干预2h后检测细胞上清液H2O2的生成;干预4h后ELISA检测细胞上清液中TGF-alpha的含量;干预12h后RT-PCR检测MUC5AC mRNA的表达;干预24h后免疫细胞化学检测细胞MUC5AC蛋白的表达。分别以Apocynin、BisindolylmaleimideⅠ预先干预pMUC5AC 3.7kb-luc转染的HM3细胞30min,再加入PA-LPS共同干预5h,然后检测细胞荧光素酶的发光强度以明确MUC5AC的转录活性。以PA-LPS干预NCI-H292细胞,RT-PCR分别检测干预6h、12h、24h后Duox1mRNA的表达水平,以明确PA-LPS是否上调Duox1的表达。分别采用Duox1、TLR4的siRNA、阴性对照siRNA转染A549细胞,转染48h后RT-PCR检测细胞Duox1、TLR4mRNA的表达情况以确定siRNA对A549细胞Duox1、TLR4表达的抑制效率,并筛选出抑制效率最高的Duox1、TLR4 siRNA分别转染A549细胞,转染48h后加入PA-LPS干预,并同前方法检测干预后H2O2、TGF-alpha的生成、MUC5AC mRNA及蛋白的表达情况。结果Nox的抑制剂Apocynin、PKC的抑制剂BisindolylmaleimideⅠ均明显抑制PA-LPS对NCI-H292细胞上清液中H2O2及TGF-alpha的上调（p＜0.01）;明显抑制PA-LPS对NCI-H292细胞MUC5ACmRNA及蛋白表达的上调（p＜0.01）;Apocynin及BisindolylmaleimideⅠ均明显抑制PA-LPS对pMUC5AC 3.7kb-luc转染的HM3细胞中MUC5AC转录活性的增强。PA-LPS分别干预A549细胞6h、12h、24h后,Duox1mRNA的表达水平无明显变化,表明PA-LPS可能通过增强Duox1的酶活性以对其进行调控。Duox1及TLR4的siRNA均有效抑制A549细胞Duox1、TLR4mRNA的表达,分别下调二者mRNA表达水平约75%。同时Duox1及TLR4的siRNA均明显抑制PA-LPS对A549细胞上清液中H2O2及TGF-alpha的上调（p＜0.01）;明显抑制PA-LPS对A549细胞MUC5ACmRNA及蛋白表达的上调（p＜0.01）。结论TLR4、PKC、Duox1均可通过对ROS、TGF-alpha的调控以介导PA-LPS上调气道上皮细胞MUC5AC的表达。PKC、Duox1均可在转录水平上对PA-LPS诱导的MUC5AC表达进行调控。本研究表明可能存在TLR4-PKC-Duox1信号通路调控PA-LPS诱导的气道上皮细胞ROS合成,进而通过ROS及其下游的信号通路TACE—TGF-alpha—EGFR调控黏蛋白MUC5AC的表达。总结通过对PA-LPS上调气道上皮细胞黏蛋白MUC5AC分子机制的研究,得出以下结论:1.ROS可通过调控TGF-alpha的合成介导PA-LPS对气道上皮细胞黏蛋白MUC5AC表达的上调,而且ROS也介导了PA-LPS对MUC5AC转录活性的增强。因此本研究表明氧化应激在PA-LPS导致的气道黏液高分泌中具有关键作用。2.TLR4、PKC、Duox1均可通过对ROS、TGF-alpha的调控以介导PA-LPS上调气道上皮细胞MUC5AC的表达,而且PKC、Duox1均可在转录水平上对PA-LPS诱导的MUC5AC表达进行调控。3.本研究表明可能存在TLR4—PKC—Duox1信号通路调控PA-LPS诱导的气道上皮细胞ROS合成,进而通过ROS及其下游的信号通路TACE—TGF-alpha—EGFR调控黏蛋白MUC5AC的表达。
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