论文摘要
卵巢癌（ovarian cancer, OC）是妇科肿瘤中致死率最高的肿瘤,严重威胁妇女的健康和生命。表观遗传学在卵巢癌研究中的进展越来越引起重视。EZH2是种甲基化酶,属于PRC复合物中重要的催化亚基,能够使组蛋白27位赖氨酸发生3甲基化,从而发挥表观遗传学的作用。组蛋白H3的27位赖氨酸（H3K27）的3甲基化能够诱导转录抑制,并参与所调控基因的表达。文献报道,EZH2在乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、结肠癌等多种肿瘤组织中表达异常增高。DZNep是EZH2的抑制剂,因其对肿瘤潜在的治疗作用备受关注。转基因小鼠是研究肿瘤发生发展的良好模型。基因敲除技术为在小鼠体内研究某-特定基因的功能提供了可行性。第一部分：EZH2对卵巢癌细胞系A2780增殖、集落形成能力的影响及机制研究研究背景：目前,对卵巢癌生物学特性、临床治疗方案以及医疗技术等方而的研究都获得了较大进展,但卵巢癌的病发率和病死率依然居高不下。EZH2是一种甲基化酶,属于PRC复合物中重要的催化亚基。它使组蛋白H3的27位赖氨酸发生3甲基化,从而发挥表观遗传学的作用。多种文献报道,EZH2在多种肿瘤组织中有高表达,例如乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、结肠癌等。EZH2可能参与到肿瘤的增殖、凋亡、迁移、侵袭、转移等过程。据此,EZH2可能会与卵巢癌细胞A2780的增殖,集落形成等功能有关。目的：通过shRNA技术下调A2780细胞系EZH2的表达,研究EZH2对A2780细胞系增殖、克隆形成能力的影响,探索EZH2在卵巢癌发生过程中的作用。方法：慢病毒感染方法构建稳定下调EZH2的A2780细胞系；MTT检测稳定下调EZH2的A2780细胞系A2780-shEZH2增殖情况；集落形成实验检测A2780-shEZH2的克隆形成能力；实时定量荧光PCR检测A2780-shEZH2细胞系中,EZH2、相关抑癌症基因CDKN2A、DAB2IP的表达情况。结果：（1） A2780-shEZH2稳定细胞系的构建及鉴定：构建稳定A2780-shEZH2细胞系A2780shEZH2-1和A2780shEZH2-2,并有效沉默EZH2的表达。（2）MTT检测A2780-shEZH2稳转细胞的增殖：MTT检测显示A2780shEZH2-1和A2780shEZH2-2在24小时、48小时、72小时的抑制率分别是72.9±4.13%和64.9±3.26%、49.9±3.37%和49±4.05%、56.1±2.18%和57.9±2.17%。与对照组相比,差异具有统计学意义（P<0.05）。（3）克隆形成能力的研究：A2780shEZH2-1和A2780shEZH2-2两组卵巢癌细胞的克隆形成能力明显下降（P<0.05）。转染对照组、A2780shEZH2-1和A2780shEZH2-2的克隆形成率分别是为9.8±0.07%,2.0±0.02%和1.9±0.03%。（4）实时定量荧光PCR检测：A2780shEZH2-1和A2780shEZH2-2中EZH2、CDKN2A、DAB2IP mRNA分别是对照组的62.8±8.12%和65.3±5.31%,230±4.31%和237±4.42%,269±7.62%和297±6.52%。A2780shEZH2-1和A2780shEZH2-2中CDKN2A和DAB2IP的mRNA明湿上调,差异具有统计学意义（P<0.05）。结论：（1）构建稳定下调EZH2的A2780-shEZH2细胞系,可作为良好的实验模型,深入研究EZH2表达调控与卵巢癌生物学功能的关系。（2）长效转染慢病毒颗粒pLKO.1-shEZH2能够高效、特异的沉默卵巢癌细胞系A2780中EZH2的基因表达。（3）长效转染慢病毒颗粒PLKO.1-shEZH2可以显著抑制卵巢癌细胞系A2780的增殖、克隆形成。（4）长效转染慢病毒颗粒pLKO.1-shEZH2可以显著抑制卵巢癌细胞系A2780中抑癌基因CDKN2A和DAB2IF,的表达,促进卵巢癌的发生。第二部分DZNep对卵巢癌A2780增殖、凋亡及迁移能力的影响和机制研究研究背景：DZNep,3-去氮腺苷的环戊醇类似物,一种广泛的甲基化转移酶抑制剂。它可降低EZH2、SUZ12、EED表达从而抑制组蛋白H3的27位赖氨酸的甲基化。文献报道DZNep在药理作用上能够抑制乳腺肿瘤细胞增殖并诱导凋亡。研究者发现DZNep能够抑制EZH2的表达,可以抑制胶质瘤和黑色素细胞迁移和侵袭。Avan等发现通过DZNep抑制EZH2并结合吉西他滨能够显著减少腺癌细胞细胞迁移,并影响增殖、细胞周期、凋亡以及迁移。Chiba等采用shRNA干扰及DZNep抑制肝脏干细胞中EHZ2的表达,两种手段都抑制肝癌干细胞的生长和球体形成。这种功能的改变可能与干扰EZH2引起的肝脏干细胞的自我更新能力受损有关。Crea等研究发现DZNep能上调抗肿瘤转移的基因的表达,从而实现能够控制肿瘤扩散的目的。目前,DZNep在乳腺癌,肺癌,脑肿瘤等方面的研究,提示其具有抗肿瘤的作用。目的：本研究通过EZH2的化学抑制剂DZNep下调EZH2的表达,观察其对A2780增殖、迁移、凋亡等功能的影响,探讨DZNep在治疗卵巢癌的可能性。方法：MTT方法检测不同浓度(2μM,4μM,6μM,8μM,10μM DZNep对卵巢癌细胞A2780增殖的影响；流式细胞术检测5μM DZNep对卵巢癌细胞A2780凋亡的作用；细胞划痕实验检测5μM DZNep对A2780迁移的影响；实时定量PCR技术检测DZNep对A2780细胞中迁移相关因子mir-101, E-cadherin的作用。结果：（1） DZNep对A2780细胞的生长抑制作用：DZNep对人卵巢癌细胞系A2780生长有抑制作用,且具有浓度依赖性。（2） DZNep对A2780细胞的诱导凋亡作用：与对照组相比,5μM DZNep处理24小时之后,12.27±1.2%的A2780细胞发生发起凋亡（P<0.05）。（3） DZNep对A2780细胞迁移能力的影响：51μM的DZNep处理卵巢癌细胞组48小时后划痕距离显著宽于对照组,两者相比差异有统计学意义（P<0.05）。（4） DZNep抑制A2780细胞迁移的机制研究：5μM DZNep处理A2780细胞系后,EZH2, E-cadherin, mir-101分别是对照组的32.7±1.1%（P<0.05）,14.6倍（P<0.05）,1.16倍（P>0.05）。结论：（1） DZNep对卵巢癌细胞系A2780具有生长抑制作用,且有浓度依赖性。（2） DZNep能诱导卵巢癌细胞系A2780的凋亡。（3） DZNep通过降低EZH2上调E-cadherin的表达,进而抑制卵巢癌细胞系A2780的迁移。（4）DZNep并未通过影响mir-101而降低EZH2的表达,从而抑制卵巢癌细胞系A2780的迁移。第三部分：EZH2对LSL K-rasG12D/p53fl/fl转基因小鼠肿瘤形成影响的研究研究背景：转基因动物可以通过插入目的基因用于过表达基因研究,或通过插入目的基因的shRNA片段来降低目的基因的本底表达,也可通过同源重组的方法获得基因敲入和基因敲除小鼠。基因敲除技术为在小鼠体内研究某一特定基因的功能提供了可能。采用此技术构建的转基因小鼠在研究卵巢癌的机制中发挥了重要作用。研究显示,卵巢癌及子宫内膜异位症存在相似的基因改变情况,比如p53, PTEN, K-ras突变,HNF-1等。Daniela等研究发现,K-ras的突变以及PTEN的突变在卵巢子宫内膜样癌中发挥过程中重要作用,也提示在卵巢子宫内膜样癌的发生过程中经过子宫内膜异位症的阶段。Kinross等利用LSL K-rasG12D以及PTEN转基因小鼠,验证了PI3K/Akt通路抑制剂PF-04691502治疗卵巢病变的作用。Johnson等研究发现,用LSL K-ras G12D转基因小鼠作为动物模型,Cre重组酶激活可诱发K-ras的突变,导致小鼠肺癌的发生。因此LSL K-ras G12D转基因小鼠常用于体内研究肿瘤机制的动物模型。目的：构建LSLK-rasG12D/p53fl/fl转基因小鼠卵巢和肺癌的动物模型,探讨EZH2在子宫内膜异位症、卵巢癌和肺癌发生发展过程中的作用。方法：构建LSL K-rasG12D/p53fl/fl转基因小鼠动物模型；构建小鼠Cre-shEZH2的质粒；观察小鼠卵巢被膜下注射病毒后,子宫内膜异位症及卵巢癌的形成；观察小鼠肺部注射病毒后,肺癌的形成。结果：（1） LSL K-rasG12D/p53fl/fl转基因小鼠的构建及鉴定：通过LSL K-rasG12D和p53wn转基因小鼠杂交,筛选得到LSL K-rasG12D/p53fl/fl阳性的转基因小鼠。（2）鼠源Cre-shEZH2-pgk质粒的构建以及体外功能的验证：构建得到小鼠Cre-shnontarget、Cre-shEZH2-1、Cre-shEZH2-3质粒。实时定量荧光PCR和western blot实验证明,与对照组Cre-shnontarget相比,Cre-shEZH2-1和Cre-shEZH2-3均可明显下调小鼠细胞内EZH2的表达。Western blot检测发现Cre-shnontarget、Cre-shEZH2-1、Cre-shEZH2-3质粒能够激活Cre酶。（3）转基因小鼠卵巢模型：本实验中的LSL K-rasG12D/p53fl/fl的卵巢注射Cre-shnontarget和Cre-shEZH2-1病毒后,并未发现转基因小鼠的卵巢在形态上有明显的改变,HE切片上也未发现卵巢表面上皮出现增生的情况,没有出现子宫内膜异位症和卵巢子宫内膜样癌的病理改变。（4）转基因小鼠肺癌模型：LSL K-rasG12D/p53fl/fl转基因小鼠的肺部注射Cre-shnontarget和Cre-shEZH2-1病毒后均出现明显的肺部肿q,瘤结节。与对照组相比,注射Cre-shEZH2-1病毒的LSL K-rasG12D/p53fl/fl转基因小鼠肺部结节数目明显减少,体积明显缩小。结论：（1）成功构建LSL K-rasG12D/p53fl/fl转基因小鼠,为研究特定基因在肿瘤形成中的作用提供动物模型。（2）成功构建小鼠Cre-shEZH2的质粒,并有效沉默EZH2的表达,为EZH2的体内研究提供了新的工具。（3）成功构建LSL K-ras G12D/p53fl/fl转基因小鼠肺癌动物模型。（4）沉默EZH2后会抑制小鼠肺癌的生长,提示EZH2可作为肺癌基因治疗的新的靶点。（5）探索了小鼠卵巢被膜下注射病毒的试验方法,为后续转基因小鼠卵巢癌动物模型的构建积累了经验。