抗菌肽Shiva-1a基因在杆状病毒中表达及山羊转基因核供体细胞的制备

论文摘要

本研究目的旨在获得一种转基因山羊胎儿成纤维细胞,为培育抗布鲁氏菌病转基因山羊新品种提供材料。首先通过杆状病毒表达系统表达Shiva-1a抗菌肽,并对其抑菌活性进行检测。然后构建抗菌肽Shiva-1a淋巴特异性真核表达载体。最后通过转染细胞并筛选转基因山羊胎儿成纤维细胞。研究取得以下结果:1根据GenBank中公布的抗菌肽Shiva-1a的氨基酸序列,设计出昆虫细胞偏爱密码子的Shiva-1a基因,并将其克隆入BAC-TO-BACTM重组杆状病毒表达系统的pFastBac Dual载体中,成功构建重组转座载体pFastBac-Shiva-1a。重组转座载体转化大肠杆菌DH10 Bac感受态细胞,经蓝白斑筛选,获得含重组杆状病毒穿梭载体Bacmid-Shiva-1a。含重组杆状病毒穿梭载体转染昆虫草地夜蛾Sf9细胞,通过Tricine-SDS-PAGE和Western Blot检测,在5kDa处检测到抗菌肽Shiva-1a表达。体外抑菌试验结果表明,Shiva-1a对大肠杆菌具有抑菌活性。2通过PCR扩增出转录和翻译终止序列SV40 ployA、山羊基因组IL-2基因的信号肽序列及其5’端调控区,将其与抗菌肽基因Shiva-1a序列共同插入骨架载体pEGFP-C1中,构建成功能够非融合表达的淋巴细胞特异性真核表达载体pEGFP-PIS,经酶切鉴定载体构建正确。3利用脂质体将淋巴细胞特异性表达pEGFP-PIS载体转染至39 d的奶山羊胎儿成纤维细胞中,经700μg/mL的G418筛选后,获得阳性细胞克隆群落。经PCR鉴定,外源目的基因Shiva-1a已稳定整合于细胞基因组中。染色体核型分析表明,该转基因细胞染色体正常,可为后续细胞核移植试验提供材料。研究结果为进一步研究抗菌肽Shiva-1a生物学活性和培育转基因抗病羊奠定基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 抗菌肽研究概况
• 1.1 抗菌肽在天然免疫系统中作用
• 1.2 抗菌肽的分类及其结构
• 1.2.1 哺乳动物抗菌肽
• 1.2.2 昆虫抗菌肽
• 1.2.3 两栖动物抗菌肽
• 1.2.4 植物抗菌肽
• 1.2.5 微生物抗菌肽
• 1.2.6 海洋动物抗菌肽
• 1.3 常用的抗菌肽数据库
• 1.4 抗菌肽基因工程
• 1.4.1 常用的抗菌肽表达系统
• 1.4.2 抗菌肽表达策略
• 1.5 抗菌肽SHIVA-1 在转基因动植物上的应用试验研究
• 第二章 抗菌肽SHIVA-1A 在杆状病毒中的表达及其抑菌活性试验
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌种、载体、细胞
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 常用溶液和培养基配制
• 2.1.4 主要仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 Shiva-1a 基因的获取与重组供体质粒pFastBac Dual-Shiva-1a 的构建
• 2.2.2 重组Bacmid 的构建及重组杆状病毒的获取
• 2.2.3 Shiva-1a 多肽的表达、鉴定及扩大
• 2.2.4 shiva-1a 多肽的抗菌活性检测
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 重组转座质粒pFastBac Dual-Shiva-1a 的鉴定
• 2.3.2 穿梭质粒的蓝白斑鉴定
• 2.3.3 重组Bacmind DNA 转染昆虫Sf9 细胞
• 2.3.4 重组杆状病毒目的基因的PCR 鉴定
• 2.3.5 Western Blot 鉴定蛋白表达结果
• 2.3.6 抑菌试验结果
• 2.4 讨论
• 2.5 小结
• 第三章 SHIVA-1A 淋巴特异性真核表达载体的构建
• 3.1 材料
• 3.1.1 菌种、载体
• 3.1.2 主要试剂
• 3.1.3 主要仪器设备
• 3.2 方法
• 3.2.1 转录和翻译终止序列SV40 ployA 基因克隆
• 3.2.2 初级真核双表达载体pEGFP-P 载体的构建
• 3.2.3 IL-2 5’调控区域的扩增
• 3.2.4 初级淋巴特异性表达载体pEGFP-PI 载体的构建
• 3.2.5 Shiva-1a 基因亚克隆
• 3.2.6 初级淋巴特异性抗菌肽表达载体pEGFP-PIS 载体的构建
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 基因组DNA 提取结果
• 3.3.2 PCR 扩增转录和翻译终止序列及初级真核双表达载体pEGFP-P 鉴定
• 3.3.3 IL-2 5’调控区域PCR 扩增及初级淋巴特异性表达载体pEGFP-PI 鉴定
• 3.3.4 Shiva-1a 淋巴特异性表达载体pEGFP-PIS 的构建与鉴定
• 3.4 讨论
• 3.5 小结
• 第四章 SHIVA-1A 特异性真核表达载体的细胞转染和筛选
• 4.1 材料
• 4.1.1 细胞
• 4.1.2 主要试剂及配置方法
• 4.1.3 主要仪器
• 4.2 方法
• 4.2.1 重组质粒的提取、纯化和浓度测定
• 4.2.2 细胞培养
• 4.2.3 脂质体介导细胞转染
• 4.2.4 细胞筛选及单克隆培养
• 4.2.5 阳性克隆的获得、扩大与转移
• 4.2.6 阳性细胞鉴定
• 4.3 结果分析
• 4.3.1 山羊胎羊成纤维细胞的原代培养
• 4.3.2 山羊胎儿成纤维细胞的生长曲线
• 4.3.3 胎儿成纤维细胞系对G418 耐受性分析
• 4.3.4 细胞筛选
• 4.3.5 阳性克隆
• 4.3.6 阳性细胞克隆的PCR 鉴定
• 4.3.7 核型分析
• 4.4 讨论
• 4.5 小结
• 结论
• 参考文献
• 主要缩略词和中英文对照表
• 致谢
• 个人简介