论文摘要
对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒（infectious hypodermal andhematopoietic necrosis virus，IHHNV）是世界各地养殖和野生对虾的重要病原之一，是已知的最小的对虾病毒，隶属于细小病毒科（Parvoviridae）短浓核症病毒属（Brevidensovirus）。它分布广泛，虽然对对虾的致死率已经不是很高，但能使已被广泛养殖的凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）生长畸形，导致慢性矮小残缺综合症（runt—deformity syndrome，RDS），造成较大经济损失。目前，GenBank已收录了分离自夏威夷、加利福尼亚、泰国、中国台湾等地的IHHNV全长或部分基因组序列。虽然中国大陆在养殖对虾中也普遍检测到了IHHNV，但未见其基因组序列报道。本论文首先利用DNA末端加尾和嵌套PCR克隆了IHHNV基因组两末端序列，并根据测定的末端序列设计引物，PCR扩增出中国福建株IHHNV基因组序列。福建株IHHNV基因组长3833nt，与夏威夷和加利福尼亚分离株相似性较高，差异主要集中于DNA的5’末端，且三者存在5’末端单核苷酸的差异。IHHNV基因组由两末端非编码序列和三个开放阅读框（open reading frame，ORF）构成。三个ORF分别包含2001nt、1092nt和990nt，预测分别编码非结构蛋白1（nonstructural protein 1，NS1），非结构蛋白2（nonstructural protein 2，NS2）和衣壳蛋白（capsid protein，CP）。本论文将全长衣壳蛋白基因克隆到pET-his表达载体，在Escherichia coli BL21中重组表达了在氨基末端融合有六个组氨酸标签的衣壳蛋白。重组IHHNV衣壳蛋白（recombinant IHHNV capsid protein，rICP）既以可溶形式也以包涵体形式表达，所以分别在天然条件和变性条件下用Ni柱亲和层析方法对不同表达形式的rICP进行纯化。电镜结果显示，可溶性的rICP可形成直径约20nm的均一的病毒样颗粒（virus—like particles，VLPs），其外观与已报道过的天然IHHNV病毒颗粒非常相似。另外，溶解于8 M尿素中的变性蛋白经纯化和透析复性去除变性剂后未能自组装成完全或不完全的病毒样颗粒。可以看出，IHHNV VLPs的形成不需要IHHNV的其他蛋白及其DNA或RNA的参与，并且融合表达的His标签展示于VLPs的表面且不影响VLPs的形成，能够与Ni—NTA树脂结合使VLPs得以富集。细胞结合实验还发现VLPs能吸附并进入凡纳滨对虾血细胞。鉴于IHHNV与白斑杆状病毒（white spot syndromevirus，WSSV）有着相似的宿主范围且两者能同时感染多种对虾，有报道称预先感染IHHNV的凡纳滨对虾在感染WSSV后能延缓死亡，期望将IHHNV VLPs改造成能携带抗病毒药物或者抗WSSV物质（如siRNA）的载体，并进入已感染WSSV的对虾细胞，发挥干扰WSSV感染或者阻断WSSV基因表达的作用，为WSSV的防治提供有力手段。