羧肽酶B在毕酵母中的表达、纯化与活性鉴定

论文摘要

羧肽酶B（carboxypeptidase B,CPB）是一类水解蛋白或多肽底物C-端Lys 或Arg的金属蛋白酶。当前,羧肽酶B 已广泛应用于蛋白质、多肽的末端修饰,急性胰腺炎及胰腺植皮排斥的血清标记,尤其在胰岛素原活化为胰岛素的过程中,羧肽酶B 是不可缺少的双酶（胰蛋白酶及羧肽酶B）之一。到目前为止,商业途径获得的羧肽酶B 主要从猪胰脏中提取,使得产品价格昂贵,同时也不可避免地混杂有其它蛋白酶,如胰蛋白酶,胰凝乳蛋白酶。本研究的目的就是试图以基因工程的方法生产一种高效价廉的重组CPB产品。本实验通过分析鼠proCPB 的基因序列,比较其密码子的组成与酵母偏爱密码子的差异,在引物设计时采用基因改构及密码子优化的策略,对鼠proCPB基因的5’序列进行了优化。实验时以RT-PCR法从SD鼠胰腺细胞中克隆了proCPB基因,将其插入pPIC9载体后,转入毕赤酵母GS115 细胞,在醇氧化酶1（AOX1）强启动子的作用下,首次实现了鼠羧肽酶原B 蛋白在毕赤酵母中的表达,并在a-因子信号肽的引导下成功地分泌到胞外。通过表达条件的优化,使用BMGY（pH 6.0）培养基,添加0.5%（m/v）的酪蛋白水解物和3 mmol/L的PMSF,于28 ℃培养,每隔12 h补加0.5%（v/v）的甲醇,重组酵母GS115-proCPB 表达的重组蛋白可达500 mg/L 以上,表达的目的蛋白占总蛋白的94%以上。表达产物经过二步疏水、二步离子交换层析及活化后,每升培养基可获得50 mg以上重组CPB 产品,得到的CPB 纯度达95%以上。活性测定表明,重组proCPB活化后的CPB 的比活力可达110 U/mg（CPB 参照品为180 U/mg）。稳定性分析表明:重组表达的CPB 很稳定,在4 ℃条件下保存5 个月后仍未发生降解,酶的活性仅降低10%。

论文目录

• 第一章 羧肽酶B的研究进展
• 1.1 羧肽酶的分类
• 1.2 羧肽酶B 的发现和命名
• 1.3 羧肽酶B 的结构特征
• 1.4 结构与功能的关系
• 1.4.1 活化过程
• 1.4.2 催化特性
• 1.5 CPB 与疾病的关系
• 1.6 CPB 的分离、纯化、重组表达与应用
• 第二章 实验部分
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 试剂
• 2.1.3 引物设计与合成
• 2.1.4 主要仪器
• 2.1.5 主要培养基
• 2.1.6 主要溶液
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 胰腺组织总RNA 的提取
• 2.2.2 第一链cDNA 合成
• 2.2.3 目的基因的PCR 扩增与回收
• 2.2.4 目的基因与载体的双酶切及回收
• 2.2.5 双酶切回收产物的连接与转化
• 2.2.6 DH5a 转化子的鉴定
• 2.2.7 毕赤酵母GS115 的PEG1000 法转化与鉴定
• 2.2.8 酵母重组子的摇瓶诱导表达与分析
• 2.2.9 GS115-proCPB 酵母菌的发酵培养
• 2.2.10 摇瓶诱导表达条件的优化
• 2.2.11 表达产物的纯化及蛋白浓度测定
• 2.2.12 重组CPB 的活性鉴定
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 SD 鼠总RNA 的提取与第一链cDNA 的合成
• 2.3.2 proCPB 基因的扩增及优化
• 2.3.3 重组质粒的构建与鉴定
• 2.3.4 毕赤酵母的转化与酵母重组子的鉴定
• 2.3.5 毕赤酵母重组子在摇瓶中的诱导表达
• 2.3.6 摇瓶诱导表达条件的优化
• 2.3.7 GS115-proCPB56 酵母工程菌的发酵培养
• 2.3.8 目的蛋白的纯化
• 2.3.9 重组CPB 的活性鉴定
• 2.4 讨论
• 2.4.1 胰腺组织总RNA 的提取
• 2.4.2 巴斯德毕赤酵母菌的转化
• 2.4.3 外源蛋白在巴斯德毕赤酵母中的表达
• 2.4.4 巴斯德毕赤酵母工程菌的摇瓶诱导条件
• 2.4.5 巴斯德毕赤酵母工程菌在5 升发酵罐中的发酵条件
• 2.4.6 目的蛋白的纯化
• 结论
• 附录
• 参考文献
• 致谢
• 个人简介