论文摘要
原发性高血压,中风,缺血性心脏病,肺动脉高压和其他一些心血管疾病是现代化社会主要引起死亡的病因。虽然在临床研究中已经投入巨资,但这些疾病还未能得到解决。而引起上述疾病的重要因素包含血管张力异常,因此对调节平滑肌收缩性的因素的研究是目前的热门课题。平滑肌的收缩是由粗细肌丝之间的相互滑动形成的,在此过程中,构成粗肌丝的肌球蛋白轻链磷酸化是启动粗细肌丝之间滑动的关键步骤。早先的认识认为构成细肌丝的肌动蛋白是固定结构,而最近的研究表明,除了肌球蛋白轻链磷酸化之外,平滑肌肌动蛋白也处于动态,肌动蛋白的聚合-解离的过程也在平滑肌张力产生中起重要作用。Abl属于非受体酪氨酸激酶家族,有证据表明在非肌肉细胞细胞中,Abl可以通过调节肌动蛋白细胞骨架结构而调节细胞迁移,伸展,胞缘波动和细胞黏附等活动。而Abl在调节平滑肌肌动蛋白骨架结构中的作用及其对于平滑肌张力方面的作用则有待进一步发掘。【目的】基于上述理论基础,本研究采用Abl基因敲除小鼠,对其与野生型小鼠的尾动脉血压,动脉血管平滑肌层厚度,在收缩刺激后的血管平滑肌肌动蛋白结构,肌球蛋白轻链磷酸化变化,及Abl下游因子及相关收缩蛋白的表达方面进行研究。探讨Abl在平滑肌收缩及细胞收缩骨架蛋白中的作用。【方法和结果】第1部分:尾动脉血压测定及血管中层厚度测量1.尾动脉血压测定方法:采用XBP1000型（Kent Scientific公司）无创尾动脉血压测量系统进行血压测量。结果:Abl基因敲除组小鼠的尾动脉血压较野生型小鼠的尾动脉血压为低,结果具有统计学意义。（2）动脉血管中层厚度测量:方法:取二氧化碳小室安乐死后的小鼠的颈动脉,冰冻切片后以相差显微镜拍照,并在专业软件下测量动脉中层厚度。结果:Abl基因小鼠和野生小鼠颈动脉中层管壁厚度相比,差异无统计学意义。第2部分:收缩刺激后,动脉血管肌球蛋白轻链磷酸化检测和肌动蛋白聚合状态检测。1.动脉血管肌球蛋白轻链磷酸化检测分组:a.野生型对照组b.野生型脱羟肾上腺素刺激组c. Abl基因敲除型对照组d. Abl基因敲除型脱羟肾上腺素刺激组方法:取二氧化碳小室安乐死后的小鼠的颈动脉,股动脉,主动脉等,以特定浓度脱羟肾上腺素刺激一定时间后以免疫印迹方法测定肌球蛋白轻链磷酸化程度。结果:在脱羟肾上腺素刺激后,Abl基因敲除型小鼠动脉和野生型小鼠动脉肌球蛋白轻链磷酸化水平无明显差异。2.动脉血管肌动蛋白聚合状态检测分组:a.野生型对照组b.野生型脱羟肾上腺素刺激组c.野生型血管紧张素2刺激组d. Abl基因敲除型对照组e. Abl基因敲除型脱羟肾上腺素刺激组f. Abl基因敲除型血管紧张素2刺激组方法:取二氧化碳小室安乐死后的小鼠的颈动脉和肠系膜动脉,以特定浓度脱羟肾上腺素和血管紧张素2刺激一定时间后以免疫荧光方法测定肌动蛋白聚合程度。结果:经以特定浓度脱羟肾上腺素和血管紧张素2刺激后, Abl敲除小鼠动脉血管由刺激引起的肌动蛋白聚合程度较野生型小鼠动脉血管降低,结果具有统计学意义。第3部分:收缩刺激后Crk相关底物磷酸化水平检测和收缩相关蛋白表达水平测定1. Crk相关底物（CAS）磷酸化水平检测分组:a.野生型对照组b.野生型脱羟肾上腺素刺激组c.野生型血管紧张素2刺激组d. Abl基因敲除型对照组e. Abl基因敲除型脱羟肾上腺素刺激组f. Abl基因敲除型血管紧张素2刺激组方法:取二氧化碳小室安乐死后的小鼠的主动脉和肠系膜动脉和股动脉,以特定浓度脱羟肾上腺素和血管紧张素2刺激一定时间后,以免疫印迹方法测定CAS磷酸化程度。结果:经以特定浓度脱羟肾上腺素和血管紧张素2刺激后,在野生小鼠动脉血管中CAS磷酸化程度增加,而Abl敲除小鼠动脉血管CAS磷酸化增加程度较野生型小鼠动脉血管降低,结果具有统计学意义。2.收缩相关蛋白表达水平检测方法:取二氧化碳小室安乐死后的小鼠的主动脉和肠系膜动脉和股动脉及肺组织。以免疫印迹方法测定paxillin, vinculin和肌动蛋白在血管组织中的水平。以定量逆转录PCR实验检测paxillin, vinculin和GAPDH的mRNA表达水平检测。结果:在Abl基因敲除小鼠动脉血管中,paxillin和vinculin蛋白水平较野生型小鼠动脉血管中相应蛋白水平低,并且在Abl基因敲除小鼠肺组织中paxillin和vinculin的mRNA水平也较野生型小鼠动脉血管中相关基因mRNA水平低。【结论】1. Abl基因敲除小鼠尾动脉血压较野生型小鼠尾动脉血压偏低。且Abl基因敲除小鼠和野生型小鼠的颈动脉中层厚度相同,提示Abl不影响平滑肌层的整体结构和厚度。2. Abl基因敲除小鼠与野生型小鼠相比,其动脉血管在受到收缩刺激后肌动蛋白聚合的增加水平降低,而肌球蛋白轻链磷酸化水平则与野生型无明显差异,提示Abl对于平滑肌张力调节是通过影响肌动蛋白细胞骨架结构而发生作用。3. Abl基因敲除小鼠与野生型小鼠相比,其动脉血管在受到收缩刺激后CAS磷酸化增加水平降低,提示Abl可能通过调节CAS磷酸化水平来调节肌动蛋白细胞骨架结构。4. Abl基因敲除小鼠与野生型小鼠相比,动脉血管和非肌性组织中肌动蛋白细胞骨架结构相关蛋白paxillin和vinculin的表达水平降低,且相应mRNA水平也降低,提示Abl对细胞骨架结构的调节机制可能有对于肌动蛋白细胞骨架结构相关蛋白表达水平调控的参与。
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